李虎　韓金祥　王延宙等

摘要：目的 探討1例成骨不全癥患者膠原合成的特征。方法 應(yīng)用3H-脯氨酸摻入法及Elisa法分別檢測成骨不全癥及發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位兩種來源的皮膚成纖維細胞的膠原合成及分泌情況。結(jié)果與結(jié)論 與發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位組相比成骨不全癥患兒細胞內(nèi)及細胞外膠原含量顯著降低（P<0.05），提示該例成骨不全患者膠原合成的異常。

關(guān)鍵詞：成骨不全癥；成纖維細胞；膠原合成

成骨不全癥（Osteogenesis Imperfecta， OI）是一種膠原合成代謝異常引起的結(jié)締組織疾病，臨床上常以骨質(zhì)疏松和骨的脆性增加，藍鞏膜，牙本質(zhì)形成不全，早熟性耳硬化為診斷標準，群體發(fā)病率約為1/15，000～25，000[1]，其中約90%的患者系I型膠原合成基因COL1A1及COL1A2突變所致[2]。成骨不全患者膠原代謝的研究已成為間接揭示該病發(fā)病機制的重要方面，本文在體外培養(yǎng)成骨不全癥患者成纖維細胞的基礎(chǔ)上定量分析其膠原合成的特征。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會批準并經(jīng)患者及家屬知情同意后，本實驗室在山東省立醫(yī)院收集實驗組成骨不全癥患者及對照組發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患者（Developmental dislocation of the hip，DDH）各一例大腿外側(cè)皮膚標本，同時調(diào)查了患者信息?；颊?，男，8歲，因"反復(fù)四肢骨折8年"入院，出生時即左側(cè)股骨中段骨折，此后因翻身、學(xué)走路等反復(fù)骨折8次，父母非近親婚配，家族中均無此類骨折史。查體：身高110cm，體重26kg，雙鞏膜藍色，牙齒易碎，桶狀胸，其它未見異常。X線片示：各長骨骨干細長，骨皮質(zhì)變薄，雙側(cè)股骨彎曲畸形。根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及X線結(jié)果診斷為成骨不全癥。發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患者與其性別、年齡一致，未患有其它疾病。

1.2主要儀器及試劑 SN-6930型液態(tài)閃爍計數(shù)器（上海核所日環(huán)光電有限公司），ZFV型微量多頭細胞樣品收集器（上海醫(yī)科大學(xué) 浙江紹興東浦醫(yī)療儀器廠），L-[2，3-3H]-Proline（中國同輻股份有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰酶細胞消化液（碧云天），人I型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒（美國R&D System公司），胃蛋白酶（Sigma），BCA蛋白定量試劑盒（貝博生物），非均相閃爍液（2.5g PPO，0.2g POPOP，100ml 無水乙醇，二甲苯補足至500ml），β-氨基丙腈（Sigma），L-抗壞血酸（Sigma）。

1.3方法

1.3.1成纖維細胞體外培養(yǎng) 用胰蛋白酶消化法分別培養(yǎng)兩種來源成纖維細胞，無菌條件下漂洗剪碎組織，消化下成纖維細胞后，轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待接近完全貼壁后用胰酶消化傳代，取第四代作為實驗用細胞。

1.3.23H-脯氨酸摻入實驗 兩組細胞每組6個副孔，以2.5×104個/0.5ml接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜至接近完全貼壁，更換含有100μg/mlβ-氨基丙腈、50μg/ml L-抗壞血酸的DMEM無血清培養(yǎng)基，37℃，5%CO2預(yù)培養(yǎng)30min后，于每孔內(nèi)分別加入1μci 3H-脯氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用胃蛋白酶消化法檢測細胞分泌至培養(yǎng)液中膠原含量[3]，細胞內(nèi)膠原含量測定采用胰酶消化，PBS清洗，多頭細胞樣品收集器收集于玻璃纖維濾膜上并依次用PBS，5%TCA和無水乙醇洗滌固定細胞后將其置于閃爍瓶，每瓶加入5ml閃爍液，液相閃爍計數(shù)儀上測定CPM值?？偰z原合成量為細胞內(nèi)及分泌至培養(yǎng)液中膠原含量之和，另以相同條件下培養(yǎng)細胞進行計數(shù)，膠原合成結(jié)果用細胞數(shù)進行校正（cpm/103細胞）。

1.3.3人I型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測 兩組細胞每組3個副孔，以105個/2ml 接種于六孔板培養(yǎng)過夜至接近完全貼壁，更換含50μg/ml L-抗壞血酸的DMEM無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細胞及培養(yǎng)液上清用于I型膠原酶聯(lián)免疫測定，同時對細胞裂解液進行總蛋白定量。測定結(jié)果以每微克細胞總蛋白中細胞內(nèi)外I型膠原總含量進行比較（pg/μg總蛋白）。

2 統(tǒng)計及分析

所得資料用t檢驗進行比較分析。

3 結(jié)果

3.13H-脯氨酸摻入值比較 細胞內(nèi)、細胞外及總膠原含量比較，OI組成纖維細胞3H-脯氨酸摻入值明顯低于DDH對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較有顯著性差異（P<0.05），見表1。

3.2I型膠原含量比較 每微克細胞總蛋白中I型膠原總含量進行比較可見，OI組細胞合成及分泌I型膠原總含量明顯低于DDH對照組（P<0.05），見圖1。

4 討論

COL1A1及COL1A2分別編碼產(chǎn)生組成I型膠原的兩條α1鏈及一條α2鏈，兩者突變均可導(dǎo)致I型膠原合成異常。根據(jù)Sillence分型標準可將此類突變的患者歸為I-IV型，本例患者出生后多次骨折致股骨畸形，藍鞏膜，牙本質(zhì)發(fā)育不全，考慮為IV型成骨不全患者，其病因為COL1A1或COL1A2突變所致，因此膠原合成能力可能存在不同程度異常。脯氨酸在I型膠原中占有一定比例，其摻入多少可反映皮膚成纖維細胞膠原合成的情況，作為研究膠原合成的常用方法其效果穩(wěn)定、可信。膠原在細胞內(nèi)合成后膠原前體后，分泌到細胞外轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炷z原，進一步交聯(lián)聚合成三螺旋結(jié)構(gòu)，由于不同來源細胞合成蛋白能力往往有所不同，因此應(yīng)用Elisa法定量I型膠原后通過細胞總蛋白含量進行校正可真實反映不同來源細胞膠原合成能力。發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位目前尚無明確結(jié)論證實其膠原合成異常，因此作為本病對照可提供膠原代謝方面的參考[4]。

Cabral等[5]在蛋白水平對特定位點突變的成骨不全患者膠原合成方面的研究顯示：患者膠原合成量減少，嚴重者膠原結(jié)構(gòu)異常。本文在細胞水平對比研究了成骨不全來源的成纖維細胞膠原合成情況，與國外研究結(jié)論一致。兩種方法的結(jié)果都反映出該例患者膠原合成能力下降，這也與其由于I型膠原合成減少導(dǎo)致的藍鞏膜、多發(fā)骨折等臨床病征一致。

另外，本研究僅對一例特定分型的成骨不全患者細胞水平的膠原合成情況進行了定量對比研究，有學(xué)者對大量樣本的回顧分析認為I型膠原三螺旋區(qū)域不同位置、不同類型突變與其表型有一定相關(guān)性[6]，而在體外細胞膠原合成水平是否有一定的關(guān)系尚需大量樣本的深入研究。

參考文獻：

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[2]Pollitt R， McMahon R， Nunn J， et al. Mutation analysis of COL1A1 and COI1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV[J]. Human Mutation，2006.

[3]李玉瑞.細胞外間質(zhì)的生化及研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1988：222-223.

[4]王利臣.先天性髖關(guān)節(jié)脫位病因?qū)W研究進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46（11）.

[5]Cabral W A， Makareeva E， Colige A， et al. Mutations near amino end of α1 （I） collagen cause combined osteogenesis imperfecta/Ehlers-Danlos syndrome by interference with N-propeptide processing[J]. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（19）： 19259-19269.

[6]Rauch， F.， et al.， Genotype-phenotype correlations in nonlethal osteogenesis imperfecta caused by mutations in the helical domain of collagen type I[J]. Eur J Hum Genet， 2010，18（6）： 642-647.編輯/哈濤