沈福玉　施建生

摘要：目的 觀察6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine， 6-OHDA）損傷早期帕金森?。≒arkinson's disease， PD）大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)部位組織學(xué)的變化特點。方法 偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA，通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗、跨步調(diào)節(jié)試驗和姿勢部對稱試驗評估注射后24 h、7 d及28 d大鼠行為學(xué)的變化；通過免疫組織化學(xué)染色觀察黑質(zhì)部位酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）陽性細胞計數(shù)的變化。結(jié)果 6-OHDA組大鼠跨步調(diào)節(jié)試驗評分減少，姿勢不對稱試驗評分增加，阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠向損傷對側(cè)旋轉(zhuǎn)，與對照組和假手術(shù)組比較統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P<0.05）；6-OHDA 7 d組、28 d組與24 h組比較，跨步調(diào)節(jié)試驗評分進一步減少、姿勢不對稱試驗評分進一步增加，阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)增加，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；6-OHDA 24 h組黑質(zhì)TH陽性細胞減少，與對照組和假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），7 d組及28 d組TH陽性細胞進一步減少，與24 h組比較統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P<0.05）。結(jié)論 通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)結(jié)合非藥物誘發(fā)試驗進行行為學(xué)評估，可確定偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA損傷早期帕金森病動物模型。

關(guān)鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺

帕金森病（PD）是常見的中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機制目前尚不清楚， 研究認為可能與遺傳、環(huán)境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應(yīng)激、過多的自由基形成及神經(jīng)生長因子缺乏等有關(guān)，是多種機制協(xié)同作用的結(jié)果[1-2]。偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現(xiàn)與人類PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點不同而存有爭議，特別是對損傷早期大鼠行為學(xué)方面的觀察比較缺乏。本實驗通過觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)部位組織學(xué)的變化特點，驗證損傷早期PD大鼠模型的穩(wěn)定性及可靠性。

1資料與方法

1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 40只SD大鼠隨機分為三組：①空白對照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個亞組；③假手術(shù)組（n=8）。

1.2.2動物模型 模型組大鼠用復(fù)合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束（mfb）三維坐標(biāo)位置，選取mfb區(qū)坐標(biāo)：前囟后2.8 mm，中線左側(cè)2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據(jù)注射位點確定鉆顱部位，手術(shù)刀尖小心鉆開一直徑約2 mm顱骨孔，微量進樣器緩慢進針至靶點，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創(chuàng)口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。并于24 h、7 d、28 d分別檢測大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變。假手術(shù)組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對照組不作任何處理。

1.2.3行為學(xué)檢測

1.2.3.1跨步調(diào)節(jié)試驗[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量僅由一側(cè)前肢支撐 ，記錄10s內(nèi)大鼠這一前肢走步次數(shù) ，然后同法檢測另一前肢的情況，以損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)所占比例（損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)/（損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)+損傷側(cè)前肢行走次數(shù)））為評價指標(biāo)。

1.2.3.2姿勢不對稱性試驗[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實驗臺上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態(tài)， 以其偏離垂直軸不超過10°為垂直位（標(biāo)準(zhǔn)位），記錄大鼠頭或上身左右擺動的情況，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記數(shù)為1次。觀察45 s內(nèi)大鼠頭或身體轉(zhuǎn)動的方向和次數(shù)，以向損傷對側(cè)擺動的次數(shù)所占比例（損傷對側(cè)擺動的次數(shù)/（損傷對側(cè)擺動的次數(shù)+損傷側(cè)擺動的次數(shù)））為評價指標(biāo)。

1.2.3.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗 模型組分別于術(shù)后24 h、7 d、28 d于動物腹腔內(nèi)注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發(fā)大鼠向右側(cè)（健側(cè)）旋轉(zhuǎn)，于阿撲嗎啡注射后5 min開始記錄，持續(xù)記錄30 min。以24 h誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)<210次/30 min，并于7 d、28 d誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)>210次/30 min為合格模型。

1.2.4組織學(xué)檢測

1.2.4.1動物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學(xué)檢測后，用復(fù)合麻醉劑麻醉，剪開大鼠胸腔，經(jīng)主動脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發(fā)白，流出液基本無色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發(fā)硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內(nèi)，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質(zhì)組織塊進行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復(fù)性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋），37℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽性產(chǎn)物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4.3 TH陽性神經(jīng)元記數(shù) 各組大鼠取包含黑質(zhì)致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計數(shù)兩側(cè)黑質(zhì)有完整細胞體的TH陽性細胞，計算左側(cè)與右側(cè)黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)的百分比（左側(cè)黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)/右側(cè)黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經(jīng)細胞計數(shù)方法進行細胞計數(shù)。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果均使用 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。單因素方差分析進行差異性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察 對照組及假手術(shù)組大鼠經(jīng)阿撲嗎啡誘發(fā)后無旋轉(zhuǎn)行為，也未出現(xiàn)非藥物誘發(fā)的行為學(xué)改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數(shù)小時即出現(xiàn)損毀側(cè)肢體動作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)緩慢旋轉(zhuǎn)，不能進行直線或隨意爬行。

2.1.1跨步調(diào)節(jié)試驗 對照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)前肢10 s內(nèi)跨步次數(shù)基本相同，模型組大鼠在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h跨步調(diào)節(jié)試驗評分出現(xiàn)有意義減少，7 d及28 d評分進一步減少，見表1。

2.1.2姿勢不對稱試驗 在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，姿勢不對稱試驗結(jié)果顯示模型組大鼠頭部和身體出現(xiàn)向右側(cè)轉(zhuǎn)動次數(shù)有意義增加，7 d及28 d姿勢不對稱試驗評分進一步增加，對照組及假手術(shù)組大鼠頭部和身體向兩側(cè)轉(zhuǎn)動次數(shù)大致相同，見表2。

2.1.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發(fā)大鼠以右側(cè)后肢為支點，首尾相接向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)<210次，7 d和28 d時大鼠阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)>210次/30 min，對照組及假手術(shù)組大鼠未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)行為，見表3。

2.2組織學(xué)檢測 抗TH染色結(jié)果顯示，在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)有意義減少，高倍鏡下見少部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經(jīng)軸突斷裂、錯亂；7 d和28 d時大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元幾乎消失，殘留的TH神經(jīng)元表現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮壞死現(xiàn)象，神經(jīng)軸突散在稀疏；模型組大鼠右側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目同時也有部分減少；對照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元無明顯改變，見表4，圖1。

3討論

研究PD需要建立穩(wěn)定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元毒性物質(zhì)，具有很強的呼吸鏈抑制作用，偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報道了應(yīng)用6-OHDA成功制備大鼠偏側(cè)PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發(fā)下產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動劑，能夠引起該模型向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，這是由于損傷側(cè)紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現(xiàn)超敏現(xiàn)象[7]，此時應(yīng)用DA受體激動劑使損傷側(cè)興奮作用占優(yōu)勢而產(chǎn)生向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。

PD的神經(jīng)保護治療需要早期進行，評估6-OHDA損傷早期大鼠行為學(xué)變化，可進一步明確模型是否成功及神經(jīng)保護性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗結(jié)合非藥物誘發(fā)的行為學(xué)試驗，其評估結(jié)果更加有效、可靠[8]。在偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后數(shù)小時，大鼠出現(xiàn)肢體動作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)不自主旋轉(zhuǎn)，不能進行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調(diào)節(jié)試驗和姿勢不對稱試驗出現(xiàn)有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導(dǎo)大鼠在原地向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，以健側(cè)后肢為支點，首尾相接，形成環(huán)狀，但旋轉(zhuǎn)次數(shù)<210次/30 min，提示此時大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元已經(jīng)受到破壞。免疫組化染色結(jié)果也表明偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元減少約30%，部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞體腫脹、核膜界限消失等早期變性征象，部分神經(jīng)軸突斷裂、錯亂。

偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h大鼠出現(xiàn)行為學(xué)和組織學(xué)方面的變化，為檢測模型的穩(wěn)定性和可靠性，實驗設(shè)立6-OHDA損傷后7d和28d組。結(jié)果顯示：大鼠行為學(xué)改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)>210次/30 min，符合成功PD模型標(biāo)準(zhǔn)；7 d和28 d時大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元減少90%。偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后，損傷對側(cè)有部分DA能神經(jīng)元丟失，可能與藥物的滲透作用或經(jīng)血液循環(huán)等有關(guān)。

綜上所述，通過早期行為學(xué)檢測，可為神經(jīng)保護性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預(yù)存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭議。

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編輯/張燕