孔祥明等

[摘要]目的：應用瘢痕疙瘩動物模型探索瘢痕疙瘩的有效治療方法。方法：用臨床患者的瘢痕疙瘩組織構建裸鼠的瘢痕疙瘩動物模型，對動物模型進行光動力試驗治療前并對動物模型治療前、后瘢痕組織的變化進行觀察分析。結果：構建的裸鼠動物模型基本保持瘢痕疙瘩的結構特征，光動力治療后瘢痕組織變小，成纖維細胞減少，膠原纖維減少。結論：光動力療法治療瘢痕疙瘩有效。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；光動力；動物模型

[中圖分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）20-1704-03

Application of photodynamic experimental research for the treatment of keloid

KONG Xiang-ming，ZHANG Ming-li，CHEN Nan，CHEN Yun-gui，LIN Ling，KE Jin-cheng，ZHUANG Ya-yan

（Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Xiamen of Xiamen Medical College，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： Objective Explore a effective method to keloid by using animal model of naked mice with keloids. Methods clinical patients with keloid tissue construct keloid animal model of nude mice，the animal models tested photodynamic therapy，and animal model of treatment before and after the change the scar tissue observation analysis. Results The fibroblasts in specimens remained the capability of synthesizing and secreting collagen，the keloid after photodynamic therapy has shrunk，fibroblasts and collagen decreased. Conclusion This procedure showed that it is feasible and reliable to use nude mice as the model of the animal with keloids， photodynamic therapy to treat keloid is effective.

Key words：keloid；PDT；model of animel

瘢痕疙瘩是皮膚傷口或不明原因所致皮損病理性愈合后形成的異常瘢痕組織。由于其發(fā)病機制不明確，所以臨床尚沒有一種療效可靠且安全的方法。盡管近年來多種方法的綜合應用使得瘢痕疙瘩的療效有所提高，但目前尚無一種滿意的治療方法[1]。本課題組利用5-氨基酮戊酸富集于異常增生組織的特性應用光動力方法對瘢痕疙瘩動物模型進行試驗治療研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：雌性裸鼠 50只，鼠齡6～8周，由廈門大學實驗動物中心提供。動物存放在預先消毒的微隔離器里，再置于隔離室的層流通風窗內(nèi)。裸鼠5鼠1籠放置，消毒、專用飼料和水喂養(yǎng)。

1.1.2病例：男，25歲。13年前無明顯誘因前胸部出現(xiàn)紅色斑丘疹，已有逐漸增大至20mm×40mm紅色光滑斑塊，術后病理檢查證實為瘢痕疙瘩（未作任何治療）。

1.1.3實驗試劑：5-氨基-4-酮戊酸鹽酸鹽粉118mg/瓶（一種光敏劑），由上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.4LED-IB光動力治療儀：由武漢亞格光電技術有限公司生產(chǎn)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的構建： 雌性裸鼠50只，分A組和B組，A組30只，分為6個小組，每組5只；B組20只，分為4個小組，每組5只，分籠飼養(yǎng)。將手術切除瘢痕組織迅速置于無菌容器的生理鹽水中，再放入裝有冰的保溫桶中，立即轉移到動物實驗室，全部操作在瘢痕離體后2h內(nèi)完成。所有操作均在無菌條件下進行，裸鼠用1 %戊巴比妥鈉按60mg/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉。在裸鼠背部左右兩側用75%酒精消毒，于兩肩胛骨處各作一0.5cm切口，潛行分離形成皮下腔隙，瘢痕組織切成約5mm×5mm×5mm大小，植入皮下腔隙中，切口用5-0無損傷縫線縫合。傷口涂酒精后裸露，術后不用任何抗生素。移植后裸鼠轉入各自籠內(nèi)飼養(yǎng)后，每天觀察，植入術后 4、8、12、16 周分批處死 30 只實驗裸鼠，每批 4 只，取出其背部的 2塊植入物，每塊切成 3部分，分別作蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）和電鏡觀察術后切取組織時進行觀察，觀察以下指標：膠原纖維形態(tài)、密度以及細胞成分， 血管形成情況以及有無變性壞死、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。

1.2.2 瘢痕疙瘩動物模型的實驗治療：首先，配制成濃度為20%的溶液，臨用前加入專用凝膠（118mg/瓶加入0.5ml），藥液必須新鮮配制，保存時間不超過4h。然后，清潔患處并保持干燥后，將配制的20%鹽酸氨酮戊酸將光敏劑配置成20%凝膠涂于事先固定裸鼠瘢痕疙瘩上的特制邊框內(nèi)，再用膠帶固定，放回飼養(yǎng)籠內(nèi)避光2h。取出涂藥的裸鼠，除去固定于瘢痕疙瘩表面的膠帶等物品，將四肢固定于試驗平板上，將其置于波長為（630±5）nm的光動力治療機下距離10cm，能量密度100Mw/cm2，照射20min。照射后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察，在照射后1、3、6周分別選取治療后不同反應者，取其移植物進行組織病理及電鏡檢查。

2 結果

2.1.1治療前大體觀察：實驗裸鼠術后全部成活，后切口無感染，完成實驗。移植后約4周，移植物周圍出現(xiàn)開始外觀似肉芽組織的粉色組織，推動移植物上的皮膚時皮下移植物與皮膚同時移動，移植物表面可見小血管，體積緩慢增大，此后移植物體積保持不變，至移植后16周移植物仍清晰可見。

2.1.2治療前組織學觀察

2.1.2.1光學顯微鏡觀察 移植后第4周，取出2只處死，切除的移植物H-E染色（如圖 1）可見被染成藍色成纖維細胞呈梭形，周圍有條狀的膠原纖維，從第4周到第16 周（如圖 2）成纖維細胞逐漸增多，膠原纖維增多，增粗呈板狀或旋渦狀排列，局部膠原逐步融合呈玻璃樣變。

2.1.2.2電鏡觀察：瘢痕組織移植至裸鼠皮下后第4 周， 透射電鏡下見較多成纖維細胞，細胞核染質(zhì)分部均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，線粒體輕度腫脹，并可見一定量膠原纖維和血管（如圖3）。至移植后第8 周，透射電鏡下見成纖維細胞增多，細胞核染質(zhì)分部均勻， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多擴張脫顆粒，膠原纖維增多，并可見彈力膜（如圖4），在移植后第12周時電鏡下除成纖維細胞核染質(zhì)分部均勻， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多擴張脫顆粒，膠原纖維多外，仍可見彈力膜（如圖5），在移植后16周電鏡發(fā)現(xiàn)成纖維細胞減少，細胞核染色質(zhì)邊集，線粒體出現(xiàn)空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張脫顆粒，膠原纖維多，可見細胞膜有斷裂 （如圖6）。

2.2.1治療后大體觀察：光動力治療后第2天開始出現(xiàn)輕度紅斑、水皰，1周開始糜爛、滲出減少、結痂，有2只反應較輕者結痂脫落，表皮下移植物無明顯變化；其余18只反應較重，糜爛及潰瘍結痂時間長痂皮后，12只3周后結痂先后脫落，表皮下移植物略縮?。?只4周后脫落，表皮下移植物縮小較明顯。

2.2.2電鏡觀察：經(jīng)光動力治療后一周取結痂脫落者1只處死，切除的移植物透射電鏡下所見，與同期（移植后5周）未處理者無明顯區(qū)別（如圖7）；經(jīng)光動力治療后3周，透射電鏡下較同期未處理裸鼠移植物相比見較多成纖維細胞，細胞核染質(zhì)分部均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，線粒體輕度腫脹，并可見一定量膠原纖維和血管（如圖8） 。經(jīng)光動力治療后9周（移植后第12 周）， 透射電鏡下見成纖維細胞減少，核染質(zhì)分部均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張脫顆粒，膠原纖維少，線粒體輕度腫脹空泡（如圖9）。

3 討論

目前，瘢痕疙瘩的治療方法很多，藥物注射治療包括糖皮質(zhì)激素、博來霉素、5-氟尿嘧啶等[2-6]，以及手術、放療、冷凍、激光等療法[7-11]，存在或療效差，或副反應大，易復發(fā)等缺點，采用二聯(lián)或三聯(lián)，甚至四聯(lián)進行綜合治療，可取得定有一定效果[12-14]，但遠沒有達到滿意程度。瘢痕疙瘩具有超過原受損范圍非限制性增生，具有一定的腫瘤生長特性[15]，因此治療比較困難。

光動力治療是通過特定波長的光源激發(fā)生物組織中的光敏物質(zhì)，引發(fā)一系列物理、化學和生物學過程。其原理是局部應用光敏劑后，光敏劑可以選擇性地富集于異常增生組織的特性通過波長為（630±5）nm的光源照射，產(chǎn)生單線態(tài)氧，繼而達到治療目的[16]。本課題組利用5-氨基-4-酮戊酸鹽酸鹽（光敏劑）富集異常增生組織（瘢痕組織）的特性，對構建的瘢痕疙瘩動物模型進行實驗治療并進行分析。應用臨床上經(jīng)病理證實的瘢痕疙瘩患者的瘢痕組織移植于裸鼠肩背部皮下后，經(jīng)過觀察及組織病理發(fā)現(xiàn)人體瘢痕組織在裸鼠體內(nèi)在一定時期內(nèi)可保持瘢痕疙瘩的結構和特性，說明所構建裸鼠的瘢痕疙瘩動物模型基本符合瘢痕疙瘩動物模型要求。光動力治療瘢痕疙瘩裸鼠的試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)光動力治療后裸鼠治療部位相繼出現(xiàn)水皰糜爛、滲出減少、結痂，結痂脫落，表皮下移植物逐漸縮小，此現(xiàn)象在組織病理得到了驗證。光動力治療后反應輕者（僅出現(xiàn)輕度紅斑，無明顯水皰）病理上與同時段未進行處理的動物模型相比較變化不明顯；光動力治療后反應明顯者（出現(xiàn)明顯水泡、糜爛、潰瘍）治療后不同時段的移植物透射電鏡下所見，與同期未進行處理者相比較有明顯區(qū)別。經(jīng)光動力治療后3周，透射電鏡下較同期未處理裸鼠移植物相比初期見較多成纖維細胞，細胞核染質(zhì)分部均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，線粒體輕度腫脹，并可見一定量膠原纖維和血管，并可見炎性細胞浸潤，可能與治療刺激有關；光動力治療后期結果顯示， 透射電鏡下見成纖維細胞減少，膠原纖維少，推測與光化學反應使得纖維細胞死亡，膠原減少，達到治療瘢痕疙瘩目的。在本課題的進行過程中，發(fā)現(xiàn)一些問題，由于目前未見有關光動力療瘢痕疙瘩方面的報告，本課題中進行光動力所采用的光敏劑的劑量及治療參數(shù)均參考了人類治療腫瘤的計量和參數(shù)，對實驗結果可能會照成一定影響，不過對于目前臨床上的頑疾—瘢痕疙瘩在治療上的探索具有一定的意義。

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[收稿日期]2014-07-25 [修回日期]2014-08-27

編輯/何志斌