吳中桓 孫廣峰 金文虎

嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積深度燒傷、慢性難愈性創(chuàng)面等的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜而重要的問題，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）研究的不斷深入，MSCs的應(yīng)用為復(fù)雜創(chuàng)面修復(fù)提供了新的方法。表皮干細(xì)胞（ESCs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs）等多種MSCs被用于創(chuàng)面修復(fù)的研究，研究證明，這些MSCs有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。在臍帶血、骨髓、外周血及脂肪等組織器官中存在多分化功能MSCs，由于倫理問題、來源有限、對機(jī)體損傷、致瘤性等多種因素限制了其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。hAMSCs具有高度自我更新能力，易于體外培養(yǎng)及擴(kuò)增，免疫原性低、無致瘤性及多分化潛能強(qiáng)等特點(diǎn)，且人羊膜是隔離胎兒和母體的一層隔膜，是產(chǎn)后廢棄物，基本不涉及倫理道德問題，取材方便、來源充足，無血管、神經(jīng)、淋巴等，使其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的意義更為深遠(yuǎn)[1]。創(chuàng)面修復(fù)是燒傷整形外科常見的難題，目前臨床常用的創(chuàng)面修復(fù)方法存在治療時(shí)間長、大面積燒傷患者皮源不足、瘢痕增生明顯、皮瓣移植術(shù)后部分或全部壞死及皮瓣術(shù)后感覺功能恢復(fù)差等問題。隨著人們對hAMSCs研究的不斷深入，用其來促進(jìn)創(chuàng)面愈合、預(yù)防瘢痕增生、促進(jìn)皮瓣存活及改善皮瓣術(shù)后感覺功能是一種有前景的治療方法之一。

1 hAMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

hAMSCs來源于外胚層的羊膜上皮細(xì)胞和中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞[2]，其分離、培養(yǎng)及鑒定尚無統(tǒng)一方案。以往用機(jī)械法成功地從人羊膜分離到hAMSCs[3]。目前多用胰蛋白酶-膠原酶消化法獲取hAMSCs。hAMSCs與BMSCs有相似的形態(tài)特征，原代細(xì)胞呈梭形、圓形、星形或多角形，傳代培養(yǎng)后一般變均勻一致，細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，梭形、排列緊密，放射狀或漩渦狀貼壁生長。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)hAMSCs有與腸道上皮細(xì)胞不一樣的微絨毛，胞漿內(nèi)有豐富的中間絲、脂質(zhì)小滴及空泡，中等量的高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和致密體，細(xì)胞或突起間可見細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)。

hAMSCs與BMSCs、ADSCs有相似的表面標(biāo)志抗原。流式檢測hAMSCs表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD166和CDl05，不表達(dá)造血和內(nèi)皮標(biāo)記CD34、CDl4、CD28、CD45、CD117和HLA-DR，表達(dá)CD49b、CD29及CD49d等整合素家族成員及CDl3、CD44、CD51、CD59、Vimentin、Nestin等間充質(zhì)干細(xì)胞特征性表面標(biāo)志蛋白。hAMSCs還表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA-3和4、OCT-4、KIF4、Sox2、Nanog，這表明其有自我更新及多分化潛能[1，4]。hAMSCs的FCM檢測不表達(dá)MHC-II類抗原HLA-DR、刺激分子CD80（B7-1）及CD86（B7-2）等，表明其具有免疫耐受特性[5]。實(shí)驗(yàn)中對其進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞茜素紅染色陽性，經(jīng)成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞油紅染色陽性，這證實(shí)了hAMSCs與其他組織來源的MSCs具有相似的多向分化生物學(xué)特性[4]。

2 hAMSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制

2.1 減輕炎癥反應(yīng)：創(chuàng)面愈合大致經(jīng)歷炎癥期、增殖期和組織重塑期3個(gè)階段。炎癥是機(jī)體組織對損傷或致病因子侵入的基本反應(yīng)，有清除異物及自身傷亡細(xì)胞及壞死組織的作用，炎癥反應(yīng)同時(shí)也激活釋放炎癥介質(zhì)，造成組織損傷及創(chuàng)面延時(shí)愈合。有研究表明損傷組織和炎性細(xì)胞釋放的炎癥因子和趨化因子有促進(jìn)內(nèi)、外源性MSCs向創(chuàng)面遷移的作用，如CCL5、CCL20、CXCL3等趨化因子及IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF、γ干擾素等炎性因子增多可使MSCs表面趨化因子及炎癥因子相關(guān)受體表達(dá)上調(diào)，促使MSCs遷移到創(chuàng)面，參與免疫調(diào)節(jié)[6]。MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能表現(xiàn)在，如促炎因子激活MSCs，使其旁分泌前列腺素E2、TNF-α刺激基因/蛋白6、斯鈣素-1（STC-1）、IL-8 、可溶性人類白細(xì)胞抗原G5（sHLA-G5）、吲哚胺二氧化酶（IDO）等，這些因子可抑制中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的遷移、趨化及樹突狀細(xì)胞的成熟，減少自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖活化；轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）及前列腺素-E2（PGE2）可促進(jìn)MSCs上調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13的表達(dá)和下調(diào)促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、γ干擾素等的表達(dá)，減輕炎性介質(zhì)反應(yīng)[7]；MSCs能分泌大量巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1、MIP-2、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-5等，選擇性募集單核細(xì)胞到傷口，減輕炎性介質(zhì)反應(yīng)[8]；MSCs分泌PGE2、IDO、sHLA-G5、肝細(xì)胞生長因子（HGF）等促進(jìn)創(chuàng)面從炎癥期過渡到肉芽組織形成及組織重塑階段；MSCs與巨噬細(xì)胞相互作用，使促炎Ⅰ型巨噬細(xì)胞型轉(zhuǎn)變到抗炎Ⅱ型巨噬細(xì)胞。

2.2 促進(jìn)肉芽組織沉積：成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，在創(chuàng)面愈合與組織修復(fù)中起著十分重要的作用。MSCs可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及抑制凋亡[7]，如：MSCs通過旁分泌纖維細(xì)胞生長因子等使成纖維細(xì)胞向傷口遷移、增殖、合成及分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，修復(fù)創(chuàng)面[9]。ASC-CM可通過上調(diào)I 、III型膠原蛋白及纖維連接蛋白，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）mRNA的表達(dá)，增加成纖維細(xì)胞分泌I型膠原蛋白及向創(chuàng)面遷移[10]。正常皮膚中以I型膠原為主，在創(chuàng)面愈合早期III型膠原表達(dá)顯著增加，提示III型膠原在創(chuàng)面愈合中有重要作用，有研究表明，III型膠原為MSCs所產(chǎn)生[11]。研究表明，MSCs分泌金屬蛋白酶抑制相關(guān)因子（TIMP）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)因子，TIMP的作用尤為關(guān)鍵。在炎癥期炎性細(xì)胞分泌大量MMP，在重塑期MMP的過度激活導(dǎo)致MMP與其抑制劑失衡，嚴(yán)重影響膠原合成，致創(chuàng)面經(jīng)久不愈，MSCs能分泌大量TIMP，恢復(fù)MMP與其抑制劑間的平衡[12]。

2.3 促進(jìn)再上皮化：在創(chuàng)面修復(fù)過程中，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞遷移、增殖及分化形成新的表皮層覆蓋創(chuàng)面。Azari等[13]采用MSCs治療全層皮膚缺損創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面可到達(dá)完全再上皮化，且炎癥反應(yīng)輕、肉芽組織薄、瘢痕減輕；有實(shí)驗(yàn)觀察到MSCs可促進(jìn)表皮細(xì)胞向創(chuàng)面中央遷移，且對MSCs移植后的愈合組織進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)MSCs表達(dá)CK19，表明MSCs可分化為表皮細(xì)胞而促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化[14]；MSCs在創(chuàng)面局部可增生分化為多種創(chuàng)面修復(fù)所需類型皮膚細(xì)胞，如：角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、外周血管壁細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、汗腺細(xì)胞等，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合及毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器的再生與重建[15-16]；Aoki等發(fā)現(xiàn)在MSCs、皮下脂肪前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的膠原基質(zhì)上接種角質(zhì)形成細(xì)胞，3種膠原基質(zhì)均可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞成活，但只有MSCs能促進(jìn)表皮網(wǎng)狀嵴樣結(jié)構(gòu)形成，并延伸到基質(zhì)內(nèi)[8]；有實(shí)驗(yàn)研究顯示MSCs分泌的IL-6、IL-8、血小板生長因子（PDGF）、上皮細(xì)胞生長因子（EGF）、角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF）及bFGF等在皮膚創(chuàng)面愈合及組織再生方面起到重要調(diào)節(jié)作用[5]；Velander等[17]發(fā)現(xiàn)自體成纖維細(xì)胞可促進(jìn)新生上皮形成。

2.4 促血管生成的機(jī)制：血管生成是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，創(chuàng)面愈合需要氧氣和營養(yǎng)成分，創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)新生血管血液能為創(chuàng)面愈合提供條件。雖然MSCs促進(jìn)血管生成的機(jī)制尚未完全闡明，但已有研究證實(shí)MSCs能表達(dá)和旁分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、色素上皮衍生因子（PEDF）、FGF2、胰島素樣生長因子（IGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、TGF-β、IL-6、EGF、血管性假血友病因子（vWF）、干細(xì)胞因子（SCF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）和血管生成素（ANG）-1等促血管生成的細(xì)胞因子或蛋白，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、創(chuàng)面血管新生，增加血管密度。如VEGF可延長內(nèi)皮細(xì)胞的壽命，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、生長和遷移，誘導(dǎo)血管發(fā)生、增強(qiáng)血管通透性等。復(fù)雜創(chuàng)面組織一般存在缺氧問題，而缺氧條件下更能誘導(dǎo)MSCs分泌這些因子。MSCs也能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖、遷移、分化及歸巢，促進(jìn)血管新生及組織再生。因此，hAMSCs能通過促血管生成、豐富創(chuàng)面血運(yùn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[18-19]。

3 hAMSCs的旁分泌

創(chuàng)面愈合是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移、上皮化、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等多個(gè)方面。MSCs的旁分泌有免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡、血管發(fā)生、化學(xué)趨化、抗瘢痕等作用，改善機(jī)體局部微環(huán)境，促內(nèi)、外源性MSCs增殖、遷移及分化，挽救瀕臨凋亡細(xì)胞，協(xié)調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，促進(jìn)多種細(xì)胞參與創(chuàng)面修復(fù)及組織重建。MSCs分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子及生物活性蛋白與多種細(xì)胞及ECM相互作用，有序調(diào)控皮膚組織修復(fù)及創(chuàng)面愈合[20]；在MSCs的培養(yǎng)液中可檢測到較高水平的EGF、HGF等細(xì)胞生長因子，其中EGF有促進(jìn)細(xì)胞增殖、表皮再生、血管形成的作用，也有刺激表皮細(xì)胞合成分泌透明質(zhì)酸、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)作用，對結(jié)締組織細(xì)胞的生長也起到促進(jìn)作用；缺氧是影響創(chuàng)面愈合的一個(gè)重要因素，MSCs能在缺氧條件下分泌多種因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合，如VEGF促進(jìn)肉芽組織生長和新生血管形成。

在損傷組織修復(fù)的炎癥期及增殖期，MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，減輕炎癥反應(yīng)；MSCs分泌特性因子促進(jìn)創(chuàng)面血管生成和刺激創(chuàng)周MSCs和創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞增殖、分化、遷移和分泌膠原蛋白，加快創(chuàng)面修復(fù)；促進(jìn)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成肉芽組織填補(bǔ)創(chuàng)面，并逐漸上皮化。重塑期，創(chuàng)面愈合質(zhì)量不佳可致瘢痕過度增生，缺乏組織再生修復(fù)，瘢痕部位缺少毛囊、汗腺、神經(jīng)末梢，存在皮膚彈性差、增生瘢痕瘙癢及破潰、活動(dòng)受限等諸多問題，影響外觀及功能，給患者生活帶來巨大負(fù)擔(dān)。因此，瘢痕問題也應(yīng)引起重視，而MSCs有重要的抗瘢痕作用。炎癥反應(yīng)不僅造成組織損傷，炎性介質(zhì)也引起過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維化，MSCs可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來減少瘢痕形成，有實(shí)驗(yàn)研究表明局部注射MSCs可有效減少瘢痕形成[21]；機(jī)體損傷時(shí)，內(nèi)、外源性MSCs可分化為內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞等，參與皮膚組織再生修復(fù)重建，減少瘢痕增生；MSC通過旁分泌抗瘢痕蛋白和促凋亡因子等實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面的塑形改造[22]，如：HGF可降低TGF-β及膠原的產(chǎn)生，減少纖維化；MSCs分泌TGF-β3、α2干擾素等抗瘢痕蛋白，調(diào)控創(chuàng)面中I、Ⅲ型膠原的比例，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖連蛋白的mRNA水平及下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（ MMP-9）的mRNA水平表達(dá)，維持細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境平衡；通過旁分泌促細(xì)胞凋亡的因子等促進(jìn)瘢痕組織中過度增殖的纖維蛋白原（Fb）發(fā)生凋亡，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面瘢痕的塑形改造[23-24]。

4 hAMSCs在皮瓣移植中的作用

皮瓣移植修復(fù)創(chuàng)面在燒傷整形外科、創(chuàng)傷外科等科室中較為常見，皮瓣移植修復(fù)創(chuàng)面可獲得理想效果，但皮瓣缺血壞死是常見并發(fā)癥，主要原因是未能及時(shí)重建血運(yùn)，皮瓣缺血、缺氧及缺血再灌注損傷等。MSCs治療能改善微循環(huán)，減輕缺血再灌注損傷，促進(jìn)早期血管化，是提高皮瓣移植手術(shù)成功的重要方法之一[19]。血管新生的發(fā)生機(jī)制主要有血管形成和血管生成，血管形成主要依靠內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及重塑完成，以出芽方式從血管床長出，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)；血管生成主要由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、分化及重塑來實(shí)現(xiàn)[25]。

以往皮瓣移植關(guān)注的重點(diǎn)是皮瓣的存活，忽視了皮瓣的感覺功能重建，隨著皮瓣移植技術(shù)的發(fā)展，患者對感覺功能恢復(fù)要求的增高，帶神經(jīng)的皮瓣移植術(shù)在臨床逐漸被推廣應(yīng)用。部分皮瓣移植術(shù)中存在神經(jīng)損傷或需吻合神經(jīng)，由于神經(jīng)的損傷，皮瓣移植術(shù)后感覺功能恢復(fù)不一定能到達(dá)理想效果[17]。MSCs可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等生物活性物質(zhì)營養(yǎng)損傷神經(jīng)，還有合成釋放神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)生物學(xué)功能[26]；對hAMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志巢蛋白和CD133，不同程度表達(dá)成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)記髓鞘堿性蛋白、酪氨酸羥化酶和神經(jīng)元特異性核蛋白。hAMSCs中存在某些神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)相關(guān)標(biāo)志，如巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ、中分子量神經(jīng)絲蛋白及膠質(zhì)纖維酸性蛋白等，表明其具有神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的生物學(xué)特性[27]；hAMSCs通過旁分泌多種細(xì)胞因子和抗炎因子調(diào)節(jié)改善損傷微環(huán)境，減輕神經(jīng)損傷；神經(jīng)生長因子（NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元的發(fā)育、再生、分化等有重要作用，軸突生長抑制因子（Nogo-A）可抑軸突再生，促進(jìn)生長錐塌陷及膠質(zhì)瘢痕形成，hAMSCs移植可上調(diào)受損神經(jīng)組織內(nèi)NGFmRNA、BDNFmRNA的表達(dá)，下調(diào)Nogo-A mRNA的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的功能修復(fù)[28]；同時(shí)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，減輕神經(jīng)組織的免疫損傷[29]。已有研究者應(yīng)用MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性及損傷性疾病，并取得了一定效果，其具有廣闊的應(yīng)用前景[30]。

5 展望

hAMSCs符合國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（International Society for Cellular Therapy，ISCT）關(guān)于MSCs的定義，與BMSCs具有相似的表型特征，一般參考BMSCs的表面標(biāo)志物及MSCs的多向分化潛能來鑒定hAMSCs。hAMSC具有擴(kuò)增能力強(qiáng)、來源充足、低免疫原性、無致瘤性及基本不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)。近年來，有細(xì)胞移植研究者用其來治療多種疾病，并取得了較好的研究成果。

創(chuàng)面愈合過程涉及細(xì)胞遷移、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及組織重塑，創(chuàng)面修復(fù)是指根據(jù)創(chuàng)面不同階段特點(diǎn)給予人為干預(yù)，以便縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間及改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。hAMSCs移植通過免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡、血管發(fā)生、化學(xué)趨化、抗瘢痕等作用，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。hAMSCs移植到宿主體內(nèi)后分泌特定的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)并激活機(jī)體固有MSCs增殖、遷移、分化，移植的hAMSCs也歸巢到宿主受損部位，定向增殖、分化為病變部位的組織細(xì)胞，參與創(chuàng)面的再生修復(fù)，預(yù)防瘢痕增生，促進(jìn)皮瓣存活及神經(jīng)功能重建。hAMSCs的諸多生物學(xué)特性在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景，但其在宿主體內(nèi)存活、遷移、分化及參與宿主器官結(jié)構(gòu)、功能整合的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究，移植到體內(nèi)后的轉(zhuǎn)歸、安全性及使用方法也需繼續(xù)探索。隨著hAMSCs分離、純化等技術(shù)的成熟，分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，其移植治療機(jī)制的逐漸闡明，hAMSCs有希望成為細(xì)胞移植和再生醫(yī)學(xué)療法的理想材料。

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[收稿日期]2014-09-17 [修回日期]2014-10-13

編輯/李陽利