趙競(jìng)伊　靳小雷　宗憲磊等

[摘要]目的：探討聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中的表達(dá)和意義。方法：臨床收集瘢痕疙瘩及正常皮膚組織標(biāo)本各10例，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及蛋白印跡方法檢測(cè)其中Aggrecan的表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：Aggrecan在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中皆有表達(dá)，但在瘢痕疙瘩中表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)增高，提示其可能參與瘢痕疙瘩形成過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]聚集蛋白多糖；瘢痕疙瘩；細(xì)胞外基質(zhì)；表達(dá)

[中圖分類號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）03-0077-03

瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是一種特殊病理性瘢痕，具有腫瘤侵襲性、生長(zhǎng)超出原始損傷范圍、不易自行消退、單純切除易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，影響美觀的同時(shí)伴隨著瘙癢、疼痛等不適，給患者身心帶來(lái)巨大痛苦。目前瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，缺乏可靠有效的治療手段，是各學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。其中瘢痕疙瘩特異性蛋白及分子標(biāo)志物，因其既可作為探討病理性瘢痕發(fā)生發(fā)展機(jī)制的突破點(diǎn)，又可作為其診治療效的檢測(cè)指標(biāo)，受到了廣泛的關(guān)注。本研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)瘢痕疙瘩蛋白進(jìn)行定量標(biāo)記檢測(cè)研究，分析其與正常皮膚的表達(dá)差異，建立了瘢痕疙瘩差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中表達(dá)上調(diào)較明顯，現(xiàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及蛋白印跡（Western blot）進(jìn)行驗(yàn)證，報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1一般資料：所有標(biāo)本取自我科2014年-2015年門診及住院患者整形手術(shù)切除的組織。瘢痕疙瘩患者，男4例，女6例；年齡24～56歲，平均37歲；患處分別為胸部4例，肩部4例，下頜2例；病程10個(gè)月～19年，平均6.3年。診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①病程超過(guò)9個(gè)月而無(wú)自發(fā)消退征象；②皮膚損害超過(guò)原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯；③以前曾行手術(shù)切除或冷凍、激光、激素封閉或放療等而又復(fù)發(fā)者。所有患者均已依靠臨床表現(xiàn)及病理檢查確診。正常皮膚標(biāo)本取自整形外科手術(shù)中切取的正常皮膚組織（Normal skin，NS），男3例，女7例；年齡28～54歲，平均32歲；取樣部位分別為面部6例，四肢4例。所有組織切取后分成兩部分，一份經(jīng)液氮速凍，-80℃保存；一份加入福爾馬林溶液固定。所有患者均簽署科研知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：倒置相差顯微鏡（Nikon公司）、組織切片機(jī)RM2135（Leice公司）、PHY-IU病理組織漂烘處理儀（常州中威電子儀器廠）、“Tissue-Tek”TEC組織包埋機(jī)、2U2-EO型臺(tái)式干燥箱（南通科學(xué)儀器廠）、組織勻漿機(jī)、分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf生物公司）。二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、蛋白裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）、鼠抗人Aggrecan一抗（英國(guó)Abcam公司）、鼠抗人β-Actin一抗（北京中杉金橋技術(shù)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色：將福爾馬林固定后的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織取材，切成約1cm×0.5cm×0.2cm的小塊后包埋，組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇逐步水化，抗原修復(fù)，采用二步法免疫組化染色，嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。Aggrecan一抗按1：100稀釋，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。Aggrecan染色以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。

1.3.2 Western Blot檢測(cè)：用總蛋白提取試劑盒分離蛋白，-80℃儲(chǔ)存，備用。以BCA方法檢測(cè)蛋白含量：50 μg總蛋白量在10%SDS-PAGE中電泳分離，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入Aggrecan一抗，4℃孵育過(guò)夜，以辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗小鼠二抗（1：10000）室溫孵育1h后，采用Super-signalWest Picokit（Pierce）化學(xué)發(fā)光試劑盒和X線膠片顯示特異性蛋白條帶，以β-actin蛋白為內(nèi)參對(duì)樣本的蛋白含量進(jìn)行校準(zhǔn)和半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組化學(xué)染色：兩組樣品染色后，顯微鏡下觀察，瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織的表皮層、真皮層細(xì)胞都有Aggrecan表達(dá)，其主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表皮細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、汗腺細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核都有表達(dá)（圖1）。比較瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織免疫組化染色陽(yáng)性灰度值（Integrated option density，IOD），瘢痕疙瘩組織陽(yáng)性灰度值與正常組織相比顯著增高（P<0.05）。

2.2 Western Blot檢測(cè)：檢測(cè)結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平明顯高于正常皮膚對(duì)照組，進(jìn)行半定量分析顯示其蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

3討論

瘢痕疙瘩組織學(xué)特點(diǎn)為大量成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)B）增生，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過(guò)度沉積、膠原纖維排列紊亂。大量研究表明，瘢痕疙瘩組織中ECM的數(shù)量和成分較正常皮膚組織有明顯改變。ECM能夠影響FB的形態(tài)、遷移、增生、分化和代謝，與細(xì)胞因子相互作用影響FB生物學(xué)功能，對(duì)瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展有明顯的調(diào)節(jié)作用。

蛋白多糖作為ECM的重要成分之一，在皮膚創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)、腫瘤發(fā)生等方面都起著至關(guān)重要的作用，目前蛋白多糖家族中的多種因子作為病理性瘢痕特異性分子標(biāo)志物研究受到了廣泛關(guān)注。

細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖主要包括兩大家族成員——大分子聚合硫酸軟骨素蛋白聚糖（the Large Aggregating Chondroitin Sulfate Proteoglycans，Lecticans）和小富亮氨酸蛋白聚糖（Small Leucine-rich Proteoglycans，SLRPs）。其中，小分子蛋白多糖家族中的核心蛋白多糖（decorin）、雙糖鏈蛋白多糖（biglycan）等都已經(jīng)被研究證實(shí)與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展相關(guān)。而Lecticans家族的多功能蛋白聚糖（versican）也是目前研究較為深入的一類細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖，它通過(guò)TGF-β₁相關(guān)調(diào)控途徑參與了病理性瘢痕的發(fā)生過(guò)程，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及膠原合成。與正常皮膚相比，versican在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕的真皮網(wǎng)狀層中顯著高表達(dá)。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是Lecticans家族的經(jīng)典成員之一，是主要表達(dá)于透明軟骨組織中的一種軟骨素硫酸化蛋白多糖。目前對(duì)Aggrecan的研究主要集中于其在骨、軟骨發(fā)育中的作用以及其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系上，探討其在皮膚增生性疾病中的表達(dá)及意義方面的研究很少。其主要特性是能夠在連接蛋白的幫助下牢固結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)重要分子透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA），從而形成大分子Aggrecan聚合體。早有研究證明HA在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞及表皮中表達(dá)顯著升高，這可能與Aggrecan形成大分子聚合體有關(guān)。Shih B的研究也發(fā)現(xiàn)了Aggrecan在瘢痕疙瘩內(nèi)部組織中的表達(dá)顯著高于其與正常皮膚交界部位的皮膚，從另一個(gè)方面也證實(shí)了Aggrecan可能與瘢痕疙瘩的增生有關(guān)。

瘢痕疙瘩作為一種發(fā)病機(jī)制尚未明確的皮膚疾病，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在各種表達(dá)異常，過(guò)表達(dá)或表達(dá)不足的細(xì)胞因子相互影響，形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，參與了瘢痕疙瘩的發(fā)病，因此開展對(duì)瘢痕疙瘩相關(guān)因子及標(biāo)志物的深入研究，進(jìn)一步明確其內(nèi)部的聯(lián)系，篩選出某種或某類對(duì)瘢痕疙瘩具有高度特異性的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，對(duì)瘢痕疾病早期快速診斷及有效治療均有重要意義。本文在前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)瘢痕疙瘩蛋白進(jìn)行定量標(biāo)記檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩中表達(dá)上調(diào)較明顯的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及蛋白印跡進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了聚集蛋白聚糖在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)水平明顯高于正常皮膚對(duì)照組，提示聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩發(fā)病中具有一定的作用，為深入開展瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制的研究增加了新的內(nèi)容。