曾建坤　林煌　李斌斌等

[摘要]目的：本研究致力于探求腺苷A_2a在低氧后處理抗凋亡中的作用。方法：從人上瞼皮膚組織中分離培養(yǎng)原代人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)6h低氧培養(yǎng)后，置于正常氧環(huán)境培養(yǎng)12h；或者經(jīng)過(guò)5min常氧/5min低氧，3次循環(huán)，即低氧后處理，之后再常氧培養(yǎng)11.5h。結(jié)果：細(xì)胞凋亡比例和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax/Bcl-2和caspase-3）表達(dá)量增高，均證明低氧/復(fù)氧可引起嚴(yán)重的損傷（P<0.05）。低氧后處理和選擇性A_2a受體激動(dòng)劑——CGS-21680均可降低前兩者（P<0.05）。同時(shí)，低氧后處理和CGS-21680均明顯活化了腺苷A_2a受體（P<0.05）。數(shù)據(jù)分析顯示，凋亡的增加量與A_2a受體蛋白的表達(dá)增加量呈顯著負(fù)相關(guān)（r2=0.8177，P<0.0001）。結(jié)論：低氧后處理通過(guò)活化皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的A_2a受體發(fā)揮抑制凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞]游離皮瓣；人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；低氧后處理；腺苷A_2a受體

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）03-0070-04

游離皮瓣移植被廣泛用來(lái)進(jìn)行器官再造或覆蓋大面積的組織缺損。手術(shù)過(guò)程中缺血再灌注不可避免地造成游離皮瓣損傷。Eltzschig研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Bax作為一種促凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放。細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)，活化caspase-9，后者又激活caspase-3，啟動(dòng)凋亡程序?？沟蛲鲆蜃覤cl-2能夠抑制Bax的活化和細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制凋亡。研究顯示，Bax/Bcl-2比值增加可以反映caspase體系的活化程度，后者在凋亡程序中出于核心地位。

2003年，Zhao等人在試驗(yàn)中采用缺血后處理減輕了缺血再灌注引起的急性心梗面積。Moon首次報(bào)道了缺血后處理有效減輕了兔皮瓣的再灌注損傷，這一研究將缺血后處理的應(yīng)用推廣到符合組織。

2007年證實(shí)，缺血后處理的抗再灌注損傷作用與心臟的腺苷A_2a受體活化有關(guān)。一系列關(guān)于缺血后處理的廣泛研究促進(jìn)了針對(duì)細(xì)胞的類(lèi)似保護(hù)措施——低氧后處理的出現(xiàn)。

我們推測(cè)低氧后處理通過(guò)活化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的腺苷A_2a受體抑制凋亡。本研究采用我們團(tuán)隊(duì)之前報(bào)道過(guò)的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，低氧/復(fù)氧和低氧后處理分別模擬游離皮瓣移植過(guò)程中的缺血/再灌注和缺血后處理。本研究的目的是：①探究低氧后處理是否能夠抗皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；②觀察不同分組的A_2a受體表達(dá)水平是否有變化，如果有變化；③研究受體活化與凋亡之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1材料：原代人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)采用的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)自重瞼術(shù)后切除的上瞼皮膚組織；CD31 MicroBeads Kit（Miltenyi Biotec，Macs，Germany）；CGS-21680（Abcam，Cambridge，England）；FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒I（BD Biosciences，BD Pharmingen^TM，USA）；抗兔Bax抗體，抗兔Bcl-2抗體，抗兔caspase-3抗體，堿性磷酸酶的羊抗兔IgG以及GAPDH（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，USA）。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組處理：細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別進(jìn)行如下處理：①對(duì)照組（CON）：細(xì)胞于常氧完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)18h；②低氧/復(fù)氧組（H/R）：細(xì)胞在含90%N₂+5%CO₂+5%O₂的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h（低氧），之后在正常氧含量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h（復(fù)氧）；③低氧后處理組（HPC）：低氧6h結(jié)束之后，細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至常氧環(huán)境5min，結(jié)束后馬上轉(zhuǎn)回低氧培養(yǎng)箱5min，執(zhí)行3個(gè)循環(huán)后再常氧培養(yǎng)11.5hin：；④H/R+CGS-21680組（H+C）：低氧和復(fù)氧前分別向培養(yǎng)基內(nèi)加入1μM CGS-21680，其他處理同H/R組。

1.2.2免疫熒光染色檢測(cè)A_2a受體：復(fù)氧結(jié)束后，經(jīng)福爾馬林固定過(guò)的細(xì)胞用0.1%Triton X-100通透15min，再用3%牛血清白蛋白室溫封閉30min。抗腺苷A_2a抗體按1：100稀釋后濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌，1：200稀釋后二抗室溫孵育。最后DAPI染核，封片。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

1.2.3流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)凋亡比例：使用FITC-AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅰ檢測(cè)細(xì)胞的凋亡比例。冷PBS洗滌細(xì)胞2次后胰蛋白酶處理。FBS終止胰蛋白酶消化作用。218g離心5min。1X結(jié)合緩沖液重懸沉淀至1×106細(xì)胞/ml。每100μl液體內(nèi)加入5μl 0f Annexin V FITC和5μl PI。室溫避光孵育15min。流式上機(jī)前加入200μl的1X結(jié)合緩沖液。另設(shè)兩組分別不加Annexin V FITC或PI，以調(diào)整流式細(xì)胞儀。

1.2.4蛋白免疫印跡每組處理結(jié)束，冷PBS洗滌細(xì)胞三次。每孔加入濃度為含150ml/1蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞后4℃離心15min。用試劑盒定量蛋白，調(diào)整蛋白濃度。蛋白樣品煮沸5min，每孔上樣25μg蛋白。將靶蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用以下稀釋的一抗孵育：抗兔Bax，抗兔Bcl-2，抗兔caspase-3以及GAPDH。二抗為堿性磷酸酶的羊抗兔IgG。Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。

1.3統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)均采用x±s方式表示。單因素方差分析方法進(jìn)行組間比較。Student-Newman-Keuls q test進(jìn)行組內(nèi)比較。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1低氧/復(fù)氧后行低氧后處理或CGS-21680處理，均能減少凋亡：如圖1，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示低氧/復(fù)氧組凋亡比例顯著高于對(duì)照組（27.76%±1.38%vs0.90%±0.31%，P<0.05），而低氧后處理組和H+C組凋亡比例分別降至16.47%±0.60%.7.63%±0.83%（P<0.05）。

為驗(yàn)證低氧后處理是否具有抗凋亡效應(yīng)，采用蛋白免疫印跡檢測(cè)Bax和Bcl-2的表達(dá)量。（圖2A、B）。與流式分析結(jié)果一致，低氧后處理和CGS-21680處理均降低了Bax/Bcl-2比值（圖2C）以及caspase-3表達(dá)量（圖2D），從而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。

2.2低氧/復(fù)氧后行低氧后處理或CGS-21680處理，均促進(jìn)了A_2a受體表達(dá)：為進(jìn)一步探究A_2a受體與凋亡相關(guān)因子的關(guān)系，我們檢測(cè)了各組中受體的表達(dá)量（圖3）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與H/R組（7.12±0.57）相比，HPC組和H+C組受體表達(dá)量分別增長(zhǎng)至11.98±0.70（P<0.05）和16.46±2.47（P<0.05）。

2.3細(xì)胞凋亡與A_2a受體蛋白表達(dá)的關(guān)系：鑒于低氧后處理與腺苷A_2a受體激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞凋亡和A_2a受體表達(dá)量的相似影響，我們假說(shuō)：低氧后處理可能通過(guò)活化A_2a受體從而抑制細(xì)胞凋亡。以CON組為基準(zhǔn)，我們計(jì)算了其余三組A_2a受體表達(dá)增加量和凋亡比例的減少量，并用Pearson相關(guān)計(jì)算兩變化量之間的關(guān)系。如圖4所示，凋亡比例增加量與A_2a受體表達(dá)相對(duì)增量呈密切的負(fù)相關(guān)關(guān)系（72=0.8177，P<0.0001），說(shuō)明低氧后處理減輕低氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡，至少部分原因是因?yàn)锳_2a受體活化。

3討論

本研究證明低氧后處理減少人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比例和線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減輕復(fù)氧導(dǎo)致的損傷。此外，我們進(jìn)一步證實(shí)低氧后處理抑制凋亡至少部分是通過(guò)活化A_2a受體實(shí)現(xiàn)的。

3.1缺血/再灌注經(jīng)線粒體途徑導(dǎo)致皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡：凋亡的確切機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，包括一系列能量依賴的分子事件。目前研究發(fā)現(xiàn)主要有兩條信號(hào)通路：死亡受體途徑和線粒體途徑。線粒體途徑起始于Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)家族，如Bax和Bcl-2。本研究中，我們檢測(cè)了Bax/Bcl-2比值和caspase-3來(lái)反應(yīng)凋亡。蛋白免疫印跡顯示，與CON組相比，低氧/復(fù)氧導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，caspase-3表達(dá)增多，即導(dǎo)致了更為嚴(yán)重的凋亡。流式細(xì)胞分析也顯示出了同樣的趨勢(shì)。之前有報(bào)道缺血再灌注可導(dǎo)致組織和器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果與之相同。

3.2腺苷A_2a受體介導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡：以往研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞在心肌缺血損傷的始動(dòng)和進(jìn)展中具有核心作用。因此，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在保護(hù)游離皮瓣的缺血再灌注損傷中具有重要作用。已有許多研究致力于減輕缺血再灌注引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，目前，腺苷成為新的研究熱點(diǎn)。腺苷是腺嘌呤核苷酸的中間產(chǎn)物，當(dāng)供氧減少或能量消耗增加時(shí)可作為一種活性物質(zhì)。內(nèi)皮細(xì)胞中腺苷代謝非?；钴S，具有強(qiáng)大的吸收和釋放核苷的能力，在機(jī)體缺血時(shí)可以作為重要的腺苷來(lái)源。反之，腺苷也能通過(guò)活化內(nèi)皮細(xì)胞的膜受體調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。腺苷受體屬于G蛋白偶聯(lián)7跨膜受體，包括A₁，A_2a，A_2b和A₃亞型。最近，有研究者已經(jīng)確認(rèn)藥物或疾病誘導(dǎo)的凋亡與腺苷A^2a受體的關(guān)系。2013年，Soleimani報(bào)道A_2a受體經(jīng)線粒體途徑在凋亡過(guò)程中起作用。與之類(lèi)似，Huang也報(bào)道了A_2a受體與線粒體依賴的細(xì)胞凋亡相關(guān)。但是不同來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特征，迄今未有人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞與A_2a受體關(guān)系的報(bào)道。本研究檢測(cè)了A_2a受體蛋白的相對(duì)表達(dá)量，探究不同組間表達(dá)是否有差異。

3.3低氧后處理通過(guò)活化腺苷A_2a受體減輕缺血再灌注損傷：我們團(tuán)隊(duì)之前已經(jīng)報(bào)道了體外構(gòu)建人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的低氧后處理模型，為研究血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與低氧后處理的關(guān)系提供了模型基礎(chǔ)。研究中，我們確定了后處理的流程：5min低氧/5min復(fù)氧，共3次循環(huán)。不同于Wang報(bào)道的5min低氧/5min復(fù)氧，共2次循環(huán)?？赡苁且?yàn)榧?xì)胞部位、來(lái)源、培養(yǎng)環(huán)境不同所致。本研究中，低氧/復(fù)氧顯著提高了凋亡比例，低氧后處理又可減輕凋亡比例，證實(shí)了低氧后處理在人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡作用。研究結(jié)果與Vetrovoi報(bào)道的結(jié)果相同，他報(bào)道低氧后處理過(guò)程中涉及凋亡相關(guān)進(jìn)程。

大量關(guān)于低氧后處理抗凋亡分子機(jī)制的研究已取得重大進(jìn)展。2009年，Leconte證實(shí)了低氧可保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，并指出HIF-1α所起的作用。此外，Wang發(fā)現(xiàn)低氧后處理通過(guò)減少ON00^-的形成減輕心肌細(xì)胞凋亡。然而，至今沒(méi)有被學(xué)術(shù)界公認(rèn)的統(tǒng)一理論。

本研究著重關(guān)注A_2a受體活化與低氧后處理的關(guān)系。蛋白免疫標(biāo)記結(jié)果顯示，與H/R組相比，HPC組與H+C組A_2a受體活化顯著增加。并且統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)凋亡比例增加量與A_2a受體表達(dá)相對(duì)增量呈密切的負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜上，A_2a受體活化至少是低氧后處理起保護(hù)作用的原因之一。

4結(jié)論

與H/R組相比，低氧后處理降低了凋亡比例，活化了A_2a受體，同時(shí)改變了線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值減小，caspase-3表達(dá)減少。我們得出結(jié)論：低氧后處理激活A(yù)_2a受體，經(jīng)線粒體凋亡途徑減輕低氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡。本研究將為低氧后處理抗凋亡機(jī)制研究提供了新的視角，為整形外科提高游離皮瓣移植成活率創(chuàng)造了理論基礎(chǔ)。