康愛建 李雙雙 顧紅兵

【摘要】目的：研究含益生元的嬰兒配方奶對(duì)腸道菌群和雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的影響。方法：以健康足月剖宮娩出嬰兒為研究對(duì)象，含益生元配方組（實(shí)驗(yàn)組）、標(biāo)準(zhǔn)配方組（對(duì)照組）、母乳喂養(yǎng)組（母乳組）各50例。在嬰兒42天、3月時(shí)采集糞便標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)腸道梭菌、大腸桿菌、雙歧桿菌及雙歧桿菌某些重要亞種如長(zhǎng)雙歧桿菌等，進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果：嬰兒42天時(shí)，三組腸道菌群及雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；3月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例比對(duì)照組低（P <0.05），且更接近母乳喂養(yǎng)組；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌比例、長(zhǎng)雙歧桿菌及短雙歧桿菌數(shù)量均比對(duì)照組高（P <0.05），且更接近母乳喂養(yǎng)組。結(jié)論：3月內(nèi)隨著月齡生長(zhǎng)，使用含益生元配方奶健康嬰兒的腸道菌群及雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的改變逐漸接近于母乳喂養(yǎng)嬰兒。

【關(guān)鍵詞】益生元 嬰兒 腸道菌群 雙歧桿菌

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2014）10-0006-02

母乳喂養(yǎng)是嬰兒獲得以雙歧桿菌為主導(dǎo)的腸道菌群，增強(qiáng)免疫功能和抗感染能力的最佳選擇。母乳中的某些成分如低聚糖，對(duì)于正常腸道菌群建立的作用至關(guān)重要。由于自身體質(zhì)、環(huán)境、工作等因素，很多母親無法哺乳，嬰兒配方乳是這些嬰兒的唯一選擇。本研究對(duì)使用添加益生元的配方奶健康足月嬰兒前三個(gè)月腸道雙歧桿菌種群進(jìn)行定量分析，以觀察配方奶對(duì)腸道菌群和雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的可能影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年7月至2011年12月我院產(chǎn)科剖宮娩出的150例健康的足月嬰兒，自愿人工喂養(yǎng)100例及純母乳喂養(yǎng)50例為觀察對(duì)象，連續(xù)觀察其生后三月內(nèi)腸道雙歧桿菌的定植發(fā)展過程并對(duì)其菌種組成進(jìn)行定量分析。入選標(biāo)準(zhǔn)：健康足月剖宮產(chǎn)娩出嬰兒（≥37孕周），出生體重2500～4000g。 排除標(biāo)準(zhǔn)：嬰兒或其父母有任何明顯的代謝性疾??；先天異常/出生缺陷；進(jìn)入研究前患有感染性疾病，使用過抗生素、益生元或益生菌制劑。所有嬰兒出生后都建議母乳喂養(yǎng)，不能堅(jiān)持母乳喂養(yǎng)的嬰兒（生后2周內(nèi)自愿從母乳喂養(yǎng)轉(zhuǎn)為奶粉喂養(yǎng)的嬰兒），隨機(jī)選擇分為實(shí)驗(yàn)組（50例）： 將被提供添加益生元的配方奶粉（精裝優(yōu)階貝護(hù)，多美滋公司）并持續(xù)使用直到3個(gè)月齡。 對(duì)照組：提供標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉（多美滋公司）。母乳喂養(yǎng)組： 生后2周內(nèi)開始純母乳喂養(yǎng)的嬰兒，將被錄入研究并被指定入母乳喂養(yǎng)組。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

3組研究對(duì)象嬰兒分別在生后42天、3個(gè)月時(shí)采集糞便樣本，采樣后立即置入無菌大便杯，途中使用干冰保存運(yùn)輸，轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室于一80℃冰箱保存，直至糞便細(xì)菌DNA抽提。

1.2.2 標(biāo)本細(xì)菌DNA的抽取

使用 QIAamp DNA stool Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany）抽提樣品糞便內(nèi)細(xì)菌基因組DNA，抽提后的DNA溶液在定量分析前凍存于一80℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 PCR引物及探針設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)各細(xì)菌16SrRNA及16S-23SrRNA序列特異性基因序列，設(shè)計(jì)合成乳酸桿菌和雙

歧桿菌種特異性引物和探針，并在BLAST基因庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）內(nèi)比對(duì)引物和探針的特異性，引物及探針由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR

雙歧桿菌和乳酸桿菌的定量檢測(cè)采用SYBR Green I熒光染料法。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10s后，各細(xì)菌循環(huán)（雙歧桿菌參數(shù)為：95℃變性10s，-60℃退火10s，-72℃延伸1min；乳酸桿菌參數(shù)為：95℃變性10s，-56℃退火10s，-72℃延伸1min），各40個(gè)循環(huán)。

雙歧桿菌亞種的定量檢測(cè)采用TaqMan水解探針法。長(zhǎng)雙歧桿菌和短雙歧桿菌擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10s，95℃變性10s，-57℃退火10s，-72℃延伸20s，各45個(gè)循環(huán)；青春雙歧桿菌擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10s，95℃變性10s，-58℃退火10s，-72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。所有Real-time quantitative PCR反應(yīng)于LightCycle 480（Roche）上進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)樣本做3個(gè)平行復(fù)孔。取確定量的細(xì)菌DNA（雙歧桿菌、乳酸桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌由上海交通大學(xué)生物醫(yī)藥研究所提供，短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所）10倍梯度稀釋后同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，采用t檢驗(yàn)；P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組嬰兒腸道菌群生長(zhǎng)情況

第42天時(shí)三組嬰兒腸道菌群生長(zhǎng)比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。第3月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌比例明顯高于對(duì)照組，且第3月時(shí)實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌比例更接近母乳喂養(yǎng)組；實(shí)驗(yàn)組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例均比對(duì)照組低，且更接近母乳喂養(yǎng)組。（* P <0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。見表1.

2.2 三組嬰兒雙歧桿菌菌種定量檢測(cè)結(jié)果

雙歧桿菌種群中長(zhǎng)雙歧桿菌檢出率較高，短雙歧桿菌檢出率相對(duì)較低，而青春雙歧桿菌檢出率更低（僅母乳組檢出1例）。實(shí)驗(yàn)第42天時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長(zhǎng)數(shù)量均表現(xiàn)為：母乳組>實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；實(shí)驗(yàn)第3月時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長(zhǎng)數(shù)量均表現(xiàn)為：實(shí)驗(yàn)組> 母乳組>對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見表2.

3 討論

嬰兒期是腸道菌群快速演替的重要階段，腸道菌群在維持人體健康方面起到重要作用，如提供生物屏障、影響營(yíng)養(yǎng)代謝功能、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)等。雙歧桿菌為主導(dǎo)的腸道菌群為嬰幼兒的腸道健康提供了獨(dú)特的保護(hù)作用，有效地減少嬰幼兒腸道、呼吸道感染的發(fā)病率。新生兒剛出生時(shí)腸道是無菌的，出生后腸道立即被來自母體和周圍環(huán)境中的微生物定植[1]。第一個(gè)影響嬰兒腸道菌群的因素為分娩方式[2]，而生后直至斷乳期，喂養(yǎng)方式是影響菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的最重要因素，母乳喂養(yǎng)可促進(jìn)嬰兒腸道雙歧桿菌形成。本研究以剖宮產(chǎn)娩出的嬰兒為研究對(duì)象，排除了分娩方式對(duì)嬰兒腸道菌群的影響因素。

研究結(jié)果顯示第3月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌比例明顯高于標(biāo)準(zhǔn)配方組，且實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌比例更接近母乳喂養(yǎng)組；實(shí)驗(yàn)第3月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例均明顯比對(duì)照組低，且更接近母乳喂養(yǎng)組。提示含益生元配方奶喂養(yǎng)能促進(jìn)嬰兒以雙歧桿菌占優(yōu)勢(shì)的腸道有益菌群的形成，且抑制腸道有害菌群生長(zhǎng)，有助于提高嬰兒腸道免疫功能，避免了多種感染發(fā)生[3]。添加益生元配方奶對(duì)嬰兒腸道菌群的影響與母乳有著異曲同工的作用。

喂養(yǎng)方式對(duì)腸道雙歧桿菌種群的多樣性也具有重要影響。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，正常健康嬰兒腸道雙歧桿菌的優(yōu)勢(shì)菌種主要為長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌及鏈狀雙歧桿菌等[4，5]，青春雙歧桿菌在過敏嬰兒腸道菌群中較為常見[6，7]。但不同人種、分娩方式、喂養(yǎng)方式、檢測(cè)方法所得出的結(jié)果有差異，故目前尚無定論。本研究顯示，三組雙歧桿菌種群中長(zhǎng)雙歧桿菌檢出率較高，短雙歧桿菌檢出率相對(duì)較低， 實(shí)驗(yàn)第42天時(shí)，三組長(zhǎng)雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長(zhǎng)數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)第3月時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長(zhǎng)數(shù)量均表現(xiàn)為：實(shí)驗(yàn)組> 母乳組>對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。僅1例母乳喂養(yǎng)嬰兒檢出青春雙歧桿菌，提示青春雙歧桿菌為嬰兒腸道雙歧桿菌非優(yōu)勢(shì)菌種。叢所周知，青春雙歧桿菌為成人腸道中雙歧桿菌的優(yōu)勢(shì)菌種，使用PCR法也可自母乳中檢測(cè)出青春雙歧桿菌[8]，推測(cè)母乳喂養(yǎng)嬰兒可能自母親皮膚接觸或母乳中獲得青春雙歧桿菌。近年來研究表明，小兒的慢性腸道炎癥及特異性疾病與其腸道內(nèi)雙歧桿菌種群構(gòu)成變化有關(guān)[9-10]。因此，研究正常嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌種群及其之間的比例，對(duì)我們了解和改善腸道菌群至關(guān)重要。但本研究樣本量偏小，研究結(jié)果仍有一定的局限性。希望在以后的研究中采用更大的樣本，引進(jìn)更為可靠的研究方法進(jìn)一步加以明確。

母乳中除了乳糖，含量最為豐富的即為低聚糖成分，目前已檢測(cè)出130多種低聚糖成分，是最佳的天然雙歧因子。隨著配方奶不斷改良，標(biāo)準(zhǔn)配方奶喂養(yǎng)嬰兒體格發(fā)育方面與母乳喂養(yǎng)嬰兒無明顯差異，但其腸道菌群的形成與母乳有很大差別。本研究提示添加益生元配方奶對(duì)嬰兒腸道菌群及雙歧桿菌菌種結(jié)構(gòu)的影響與母乳有著相似的作用，亦能促進(jìn)嬰兒腸道雙歧桿菌形成，阻止病原微生物腸道內(nèi)定植，預(yù)防腹瀉及腸道感染，緩解便秘，增強(qiáng)免疫功能，減少過敏的發(fā)生。

總之，本研究結(jié)果提示，母乳是嬰兒最好的天然食品，添加益生元配方奶對(duì)嬰兒腸道雙歧桿菌誘發(fā)有著類母乳化作用，是人工喂養(yǎng)嬰兒良好的食品來源。

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通訊作者：顧紅兵

注：南通大學(xué)自然科學(xué)項(xiàng)目[10Z094]