李博勛等

摘 要 在海南省儋州市的三藥檳榔（Areca triandra Roxb）苗圃中發(fā)現(xiàn)一種為害嚴(yán)重的葉斑病。根據(jù)該病的病原菌形態(tài)特征以及ITS序列分析，鑒定該病原為克盧亞擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]。病原生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，該病原菌菌絲生長的適宜溫度為28 ℃，pH為6.5，適宜的碳源為 D-麥芽糖和D-葡萄糖，適宜氮源為硝酸鉀和硝酸鈉；光暗交替有利于菌絲生長及產(chǎn)孢；孢子萌發(fā)的適宜溫度為30 ℃，pH為5.5，孢子致死溫度為50 ℃，10 min。采用含毒介質(zhì)法對(duì)4種藥劑進(jìn)行室內(nèi)敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該病原菌菌絲生長對(duì)50%多菌靈（WP）敏感性最高，50%異菌脲次之。

關(guān)鍵詞 三藥檳榔；葉斑??；擬盤多毛孢菌；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S792.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Identification and Biological Characteristics

Analysis on the Pathogen of Areca triandra

LI Boxun1，WANG Yanli1，XIE Changping2，SHI Tao1，HUANG Guixiu1*

1 Environment and Plant Protection Institute，China Academy of Tropic Agricultural Sciences/ Key Laboratory of

Integrated Pest Management on Tropical Grops，Ministry of Agriculture，P.R.China/Hainan Key Laboratory

for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou，Hainan，571101，China

2 Environment and Plant Protection college，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China

Abstract Areca triandra（Areca triandra Roxb.）Pestalotiopsis leaf spot is an important disease in A. triandra， which can affect the growth and ornamental value of A. triandra. The pathogen was identified P. clusiae（Griffon&Maubl）by biological characteristics and molecular biology. The optimal temperature for mycelium growth was 28℃ and for conidial germination was 30 ℃，however the temperature higher than 50 ℃ was not beneficial for conidium. Acidic conditions conducive to the growth of pathogen， the optimal pH values for mycelium growth was 6.5 and for conidial germination was 5.5. 4 fungicides was screened in laboratory by hypha growth rate method. Carbendazim 50%WP and 50% Iprodione EC could restrain effectually the growth in Lab.

Key words Areca triandra；Pestalotiopsis clusiae；Pathogen identification；Biological characteristics.

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.025

三藥檳榔（Areca triandra Roxb.）又稱為三雄芯檳榔，屬棕櫚科檳榔屬植物；原產(chǎn)于印度、馬來西亞等國家的熱帶地區(qū)，20世紀(jì)60年代引入中國，隨后被廣泛種植于華南、西南及沿海地區(qū)[1]。三藥檳榔株型高大，氣勢(shì)雄偉，青翠濃綠、優(yōu)美壯觀，富有濃烈的熱帶風(fēng)光氣息，為南方熱帶園林綠化工程中不可缺少的優(yōu)良樹種[2]。近年來，筆者在海南省儋州市的許多三藥檳榔樹上均發(fā)現(xiàn)了一種葉斑病，該病主要為害三藥檳榔葉片，病斑為灰白色、邊緣呈黑褐色壞死，密集且連接成片，導(dǎo)致葉片枯萎、倒垂。在隨后的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病在海南?？凇①僦?、三亞的三藥檳榔上都普遍發(fā)生，葉片發(fā)病率已達(dá)70%～80%，嚴(yán)重影響了三藥檳榔的觀賞價(jià)值。目前關(guān)于三藥檳榔病害的研究國內(nèi)外都鮮有報(bào)道。但有報(bào)道說在棕櫚科其他屬的植物如椰子、加拿利海棗[4]、大王棕、華棕[5]、散尾葵等[6]上發(fā)現(xiàn)由擬盤多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）侵染所造成的病害，這些病害的發(fā)病癥狀與三藥檳榔葉斑病的癥狀比較相近，它們的致病菌是否相同或者是否能夠交互侵染還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。鑒于目前報(bào)道的有關(guān)棕櫚科植物的研究僅限于對(duì)病原菌的鑒定，關(guān)于其病原的生物學(xué)特性及防治策略并未見更深入的研究和報(bào)道。為了更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生及為害，掌握該病的發(fā)生規(guī)律及流行條件，本研究對(duì)海南地區(qū)三藥檳榔的主要種植區(qū)進(jìn)行三藥檳榔葉斑病的調(diào)查，并對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定，同時(shí)進(jìn)行生物學(xué)特性分析和防治藥劑的篩選，為生產(chǎn)上防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣來源 樣品采自海南省儋州市三藥檳榔苗圃。采集具有典型癥狀特點(diǎn)的三藥檳榔病葉樣品，保濕備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基PDA的配制參照方中達(dá)[7]的方法。Richards培養(yǎng)基配方：KNO3 10 g；KH2PO4 5 g；MgSO4·7H2O 2.5 g；FeCl2 0.02 g；蔗糖50 g；水1 000 mL。

1.1.3 試劑、引物及菌株 DNA 片段回收試劑盒、 pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；Taq 酶、dNTP等生化試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；rDNA ITS序列分析通用引物為 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由北京六合華大基因有限公司合成；大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離、純化及其致病性測(cè)定 采用常規(guī)組織分離法和瓊脂平板稀釋法[7]對(duì)田間自然發(fā)病的典型三藥檳榔葉片進(jìn)行病原菌的分離及純化。在田間選取健康的三藥檳榔葉片，依照柯赫氏法則[4]將分離純化后的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定，以不含病原菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，將樣品置于28 ℃中保濕培養(yǎng)，待其發(fā)病后從發(fā)病部位重新分離病原菌并觀察菌落形態(tài)特征以及分生孢子形態(tài)，用最初分離得到的菌株作對(duì)比，確認(rèn)分離物的致病性。

1.2.2 病原鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定：根據(jù)病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲顏色等特征來鑒定。用Nikon Eclipse 80i 顯微鏡（Tokyo，Japan）對(duì)分生孢子的形態(tài)、顏色、大小、附屬絲長度等進(jìn)行描述，用附帶的ACT-1軟件和DXM1200F相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。

（2）rDNA -ITS序列分析：采用CTAB方法[8]提取病原菌DNA。參照裴月令等[9]的方法，用rDNA ITS序列分析通用引物ITS1和ITS4，對(duì)病原菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說明書對(duì)目的條帶進(jìn)行回收和克隆，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將已測(cè)定得到的序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.2.3 生物學(xué)特性分析 （1）病原菌基礎(chǔ)生物學(xué)特性測(cè)定。①病原菌菌絲生長特性測(cè)定：將供試病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上于28 ℃培養(yǎng)5 d，用無菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑為4.5 mm的菌齡相同的菌餅備用。調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5后分別制成平板；用等量的碳源（蔗糖、葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖和肌醇）及氮源（硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、和草酸銨）依次替換Richards培養(yǎng)基中的蔗糖和硝酸鉀，以不加任何碳源（蔗糖）和氮源（硝酸鈉）的Richards培養(yǎng)基作為對(duì)照，滅菌后，制成平板備用。分別將病原菌菌餅接種到不同pH，不同碳、氮源的PDA培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。另外將病原菌菌餅轉(zhuǎn)移到干凈的PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱以及完全光照、光/暗交替和完全黑暗的28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，4 d后觀察各培養(yǎng)條件下菌絲的生長情況，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長速率，用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離及其致病性測(cè)定

三藥檳榔擬盤多毛孢葉斑病主要為害葉部，尤其是下層葉片。發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)黑褐色圓形或不規(guī)則形的病斑，病斑邊緣有黃色暈圈；隨著病斑逐漸擴(kuò)大，向兩端延伸呈橢圓形或近圓形，病斑邊緣呈黑褐色，中央變?yōu)榛液稚?，病斑邊緣有黃色暈圈；后期多個(gè)病斑連接成片，形成不規(guī)則的大型病斑，病斑邊緣黑褐色，中央灰白色，其上散生許多小黑點(diǎn)，黃色暈圈不限于病斑邊緣（如圖1A～C）。于田間采集病樣，從病健交界處分離病原菌，將病原菌進(jìn)行單孢純化后保存?zhèn)溆?。病菌編?hào)為AtCP-1。

按照柯赫氏法則[11]將AtCP-1菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果表明，AtCP-1菌株侵染三藥檳榔葉片后的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相同，再從發(fā)病葉片上將病原菌進(jìn)行分離，所得病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)以及分生孢子的形態(tài)特征，與在田間自然發(fā)病得到的病原菌形態(tài)特征一樣，證實(shí)該分離菌為三藥檳榔葉斑病致病菌（如圖1-D）。

2.2 病原鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈圓形、邊緣整齊；菌絲為純白色、生長旺盛，棉絮狀、中部稍隆起（圖2-A），菌落背面有橘紅色色素，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后產(chǎn)孢，產(chǎn)孢后菌落背面無明顯的產(chǎn)孢輪紋；分生孢子群落為黑色，不規(guī)則地散生于氣生菌絲上（圖2-B）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，三藥檳榔擬盤多毛孢葉斑病病原菌的分生孢子為長梭形，有的稍微彎曲，每個(gè)分生孢子是4隔5細(xì)胞；分生孢子大小為[（19.42～25.32）（21.64）]μm×[（5.70～7.91）（6.85）]μm（隨機(jī)測(cè)量100個(gè)分生孢子），中間3個(gè)細(xì)胞均為褐色，成熟的有色胞第一色胞顏色略淺，淺褐色，第二色胞顏色最深，深褐色，第三色胞次之；有色胞長12.90～15.89（13.89）μm。頂胞和尾胞均為三角形，無色透明；頂胞上著生無色附屬絲，2～3根，長20.41～25.91（22.82）μm；尾胞上著生一根基部附屬絲，中生，長3.20～6.80（4.90）μm（圖2-C）；芽管是從第三個(gè)有色胞側(cè)面萌發(fā)。參照張家祥[12]的研究結(jié)果從形態(tài)上將該病原菌鑒定為半知菌類、腔孢綱、黑盤孢目、擬盤多毛孢屬的克盧亞擬盤多毛孢菌 [Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]。

2.2.2 rDNA ITS序列分析 對(duì)該病原菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條約0.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)克隆和測(cè)序可知該序列全長509 nt，將該序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號(hào)：KF811605。經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄的Pestalotiopsis clavispora（JX875596.1）Pestalotiopsis foedans（JN943631.1）擬盤多毛孢病菌ITS序列的同源性高達(dá)100%。

2.3 病原菌生物學(xué)特性分析

2.3.1 病原菌基礎(chǔ)生物學(xué)特性測(cè)定 根據(jù)病原菌菌絲和分生孢子生長特性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AtCP-1擬盤多毛孢菌菌絲生長的適宜溫度是28 ℃，低于15 ℃或高于35 ℃，菌絲生長受抑制或不能生長（圖3-A）；適宜的pH值為6.5（圖4-A）；光/暗交替培養(yǎng)最有利于病原菌生長（圖5）；該菌在含D-乳糖的培養(yǎng)基中其菌絲生長最快，但菌絲稀疏，生長力不旺盛，在含有D-麥芽糖和D-葡萄糖的培養(yǎng)基中菌落的生長狀況最好，菌絲致密旺盛，生長速度快，說明D-麥芽糖和D-葡萄糖是該菌生長的最適碳源（圖6-A）。該病原菌對(duì)硝酸鹽類的利用情況明顯優(yōu)于銨鹽類，在含硝酸鉀和硝酸鈉的培養(yǎng)基上生長的速度最快（圖6-B），菌絲濃密，是該菌生長的最適氮源。

分生孢子萌發(fā)的適宜溫度范圍在25～30 ℃之間，最適溫度是30 ℃，低于10 ℃或高于40 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率都很低（圖3-B）；適宜pH范圍在3.5～5.5之間，最適pH為5.5（圖4-B）。將孢子置于50 ℃水浴鍋中處理10 min后孢子不能萌發(fā)，說明孢子致死溫度為50 ℃

2.3.2 病原菌對(duì)室內(nèi)藥劑的敏感性測(cè)定 各供試藥劑濃度對(duì)數(shù)與生長抑制率幾率值之間表現(xiàn)出線性相關(guān)，其濃度對(duì)數(shù)——生長抑制率幾率值的毒力回歸方程見表2。從表中可以看出，4種藥劑中，病原菌菌絲生長對(duì)50%多菌靈（WP）敏感性最強(qiáng)，EC50為0.107 6 mg/L；50%異菌脲次之，EC50為2.233 9 mg/L。與前2種藥相比，代森錳鋅和腈菌唑的抑菌效果相對(duì)較差，建議生產(chǎn)上使用多菌靈和異菌脲對(duì)該病進(jìn)行防治。

3 討論

棕櫚科植物是世界熱帶地區(qū)最主要的油料作物和觀賞植物，有著廣闊的發(fā)展前景。近10年來隨著城市綠化事業(yè)的發(fā)展，棕櫚科植物已成為了不可或缺的園林綠化資源。三藥檳榔作為其中1種重要的綠化苗木在中國的華南、西南以及沿海地區(qū)廣泛種植，成為美化城市環(huán)境主要的綠化植物。筆者2008年8月在海南省儋州市的三藥檳榔苗圃地發(fā)現(xiàn)三藥檳榔葉斑病的為害，植株發(fā)病率達(dá)70%～80%，經(jīng)分離純化得到了1株三藥檳榔擬盤多毛孢葉斑病菌AtCP-1，經(jīng)鑒定知該病原菌與張家祥等[12]報(bào)道的克盧亞擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀極為相近。通過對(duì)其生物學(xué)特性及藥劑敏感性測(cè)定可知，該病原菌生長適宜的溫度、pH分別為28 ℃、6.5，以D-麥芽糖和D-葡萄糖為最佳碳源，硝酸鉀和硝酸鈉為最佳氮源；孢子萌發(fā)適宜的溫度和pH分別為30 ℃、5.5。該病原菌可影響植株的長勢(shì)和觀賞性，其在田間典型的發(fā)病癥狀是病斑中央灰白色邊緣的黑褐色壞死線周圍有明顯的黃色暈圈，人工接種的葉片發(fā)病癥狀和田間自然發(fā)病的癥狀略有差異，但是均能形成壞死斑和明顯的黃暈。保濕培養(yǎng)能在病斑中央看到黑色小顆粒狀突起，為病原菌的分生孢子。

目前有關(guān)棕櫚科植物病害的研究和報(bào)道都較少。2000年金亮等[4]發(fā)現(xiàn)廈門地區(qū)棕櫚植物出現(xiàn)相關(guān)病害，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)擬盤多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）能侵染為害加拿利海棗、椰子、散尾葵、酒瓶椰子、棍棒椰子等棕櫚科植物。吳麗民等[5]通過癥狀比對(duì)和切片觀察共鑒定了大王棕、華棕、刺葵和海棗上由擬盤多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）引起的4種病害。李建宏等[6]發(fā)現(xiàn)由小孢擬盤多毛孢[Pestalotiopsis microspora （Speg.）Satista & Peresapud Batista]侵染引起的散尾葵葉斑病在?？诘貐^(qū)發(fā)病嚴(yán)重。盡管該類病原菌在棕櫚科植物上普遍發(fā)生為害，但在已有報(bào)道中，有關(guān)該類病原菌的研究僅限于對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，而關(guān)于該病原菌的深入研究以及防治策略都鮮有報(bào)道。本研究對(duì)AtCP-1的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)其與枇杷、芒果、桂花等經(jīng)濟(jì)作物上報(bào)道的擬盤多毛孢病菌的生物學(xué)特性相似[13-15]，偏酸性和高溫高濕的環(huán)境有利于該病原菌的生長和孢子的萌發(fā)。7～8月是該病發(fā)病的高峰期，與此時(shí)期的高溫多雨天氣有利于病原菌的傳播和擴(kuò)散有關(guān)，再加上該病原菌寄主范圍較廣，能為害除三藥檳榔以外的其他棕櫚科植物如椰子、油棕、散尾葵等。

為了更好的控制該病害的發(fā)生，同時(shí)也避免該病原菌傳播到其他觀賞植物上，本研究對(duì)4種化學(xué)藥劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%多菌靈（WP）的抑菌效果最好，其次是50%異菌脲，84%代森錳鋅WP和12.5%腈菌唑EC的抑菌效果較差。通過與楊秀娟等[13]和管斌等[16]得出的枇杷和紅葉石楠上擬盤多毛孢病菌的室內(nèi)、外毒力測(cè)定結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，擬盤多毛孢病原菌對(duì)氨基甲酸酯類和咪唑類殺菌劑的敏感性最高，而對(duì)三唑類和二甲酰亞胺類的殺菌劑敏感性較低。綜合考慮藥劑在環(huán)境中的降解性能、藥劑的防效和成本，筆者推薦采用多菌靈和異菌脲作為生產(chǎn)上防治三藥檳榔擬盤多毛孢葉斑病的首選藥劑。通過對(duì)三藥檳榔擬盤多毛孢葉斑病菌的生物學(xué)特性及防治藥劑的篩選等分析研究，能更好地了解該病的發(fā)病條件、流行關(guān)鍵生態(tài)因子，同時(shí)為該病害的防治提供理論參考，也為由擬盤多毛孢病菌引起的其他棕櫚科植物的病害防治提供參考依據(jù)。

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