朱楠等

摘 要 采用卡寶品紅染色壓片法對黃花煙草（Nicotiana rustica）、栽培煙草（Nicotiana tabacum L. Var. K326）和殘波煙草（Nicotiana repanda）的小孢子發(fā)生發(fā)育過程進行研究。結(jié)果表明：黃花煙草、栽培煙草K326及殘波煙草小孢子發(fā)生和發(fā)育過程的胞質(zhì)分裂皆為同時型，四分體有十字交叉型、正四面體型和左右對稱型3種構(gòu)型，成熟花粉粒為2細胞型。3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程基本正常，但不同程度地出現(xiàn)了減數(shù)分裂異常現(xiàn)象，如同一花藥內(nèi)小孢子發(fā)育不同步以及同一細胞內(nèi)染色體步調(diào)不一致、染色體橋、染色體落后、微核等。

關(guān)鍵詞 煙草；小孢子；雄配子體；減數(shù)分裂

中圖分類號 S572 文獻標(biāo)識碼 A

Microsporogenesis and Male Gametophytic Development

of Three Species of Nicotiana

ZHU Nan1， LIAO Jugou1， SONG Biqing2， SUO Wenlong2

YAO Heng3， CHEN Suiyun1 *， MA Wenguang3 *

1 School of Life Science， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091， China

2 Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ldt.， Yuxi， Yunnan 653100， China

3 Tobacco Research Institute， Yuxi， Yunnan 653100， China

Abstract The microsporogenesis and development of male gametophyte of Nicotiana rustica， Nicotiana tabacum L. Var. K326 and Nicotiana repanda were observed via light microscopy after staining with carbolfuchs. Results showed that ： meiosis in microspore was simultaneous cytokinesis in the development of male gametophyte of Nicotiana tabacum L. Var. K326， Nicotiana rustica and Nicotiana repanda. Cytokinesis at meiosis of microspore mother cells was simultaneous and tetrads were mostly decussate， tetrahedral and isobilateral. The mature pollens belong to 2 cells type. Microsporogenesis and development of male gametophyte of different tobacco are in common with those of others. However， the phases of meiosis of microspore mother cells in some cultivars developed abnormally in the same microsporangium to some extent. The chromosomes were out of step in the same cell， with laggard chromosomes， chromosome bridges or micronucleus.

Key words Nicotiana； Microsporogenesis； Male gametophyte； Meiosis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.004

煙草隸屬雙子葉植物綱（Dicotyledoneae），茄科（Solanaceae），煙草屬（Nicotiana）[1]。煙草屬包括3個亞屬：黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabacum）和碧冬煙亞屬（Petuuioides），共計66個種。黃花煙草為黃花煙草亞屬（Rustica）黃花煙草組（Rusticae）中僅有的1個種，原產(chǎn)于南美洲，是我國栽培利用的重要煙草種之一[2]。普通煙亞屬中的栽培品種K326（Nicotiana tabacum L. Var. K326）是廣泛種植的烤煙品種[3]，栽培煙草遺傳基礎(chǔ)狹窄，對許多病蟲害不具抗性[4]。N. repanda W.屬于碧冬煙亞屬，對多種病蟲害等具有高抗性，是栽培煙草改良的天然基因庫[5]。目前對煙草的研究主要集中在抗病性[6]、栽培模式[7]、環(huán)境調(diào)控技術(shù)[8]、基因組學(xué)[9]等方面。煙草大小孢子的發(fā)生發(fā)育過程直接影響該物種的生殖和繁衍，決定著煙草種質(zhì)資源的保持和開發(fā)利用。康紅梅[10]等研究了煙草大孢子發(fā)生發(fā)育過程，但針對煙草小孢子發(fā)育相關(guān)的研究報道較少。本研究通過對3種不同煙草的小孢子發(fā)生發(fā)育過程進行觀察比較，以期為煙草的系統(tǒng)分類、遺傳育種、種質(zhì)資源優(yōu)化等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為種植于昆明市官渡區(qū)試驗田的黃花煙草、栽培煙草K326、殘波煙草。材料于2011年8月移栽，花期為2011年9月至2011年11月。在現(xiàn)蕾期分別采集各種煙草生長直徑短于0.5 cm的花蕾各30朵，放入Carnoy固定液（無水酒精 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）固定24 h后，轉(zhuǎn)移到70%的酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

將準(zhǔn)備好的材料轉(zhuǎn)入45%的冰乙酸中軟化20 min，按花蕾的大小不同分類，由小到大取出花藥，分別置于干凈的載玻片中央，滴加少量卡寶品紅，用鑷子擠壓出花粉粒，蓋上蓋玻片，壓片，置于Olympus顯微鏡下觀察及拍照[11]。

2 結(jié)果與分析

3種煙草花均為兩性花，每朵花5個花藥，每個花藥具4個花粉囊。在花蕾早期，花粉囊內(nèi)表皮下的孢原細胞首先進行1次平周分裂，形成兩層細胞，即外層的初生壁細胞和內(nèi)層的造孢細胞。初生壁細胞進行平周分裂形成內(nèi)外兩層次生壁細胞，連同外面的表皮共3層細胞。同時造孢細胞也不斷分裂分化而形成次生造孢組織。次生造孢細胞排列緊密、體積大、胞質(zhì)濃厚、核仁大而顯著， 由其進行不斷的分裂分化而發(fā)育形成小孢子母細胞。小孢子母細胞周圍開始沉積胼胝質(zhì)，最終形成一層胼胝質(zhì)壁，隨著胼胝質(zhì)壁不斷增厚，它由不規(guī)則的形狀變成圓形，隨后彼此分離開始進入減數(shù)分裂期。減數(shù)分裂前核內(nèi)出現(xiàn)一團明顯的細絲狀染色質(zhì)，并與核仁連在一起處于核的一側(cè)，可作為減數(shù)分裂起始的標(biāo)志。黃花煙草小孢子的減數(shù)分裂與其他兩個煙草種基本相似，在此以黃花煙草減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育過程為例闡述三者之間的共性。

2.1 黃花煙草小孢子減數(shù)分裂過程

減數(shù)第一次分裂前細線期（圖版Ι-1），此時細胞核腔內(nèi)充滿了細長、線狀的染色體，細胞核和核仁增大，隨后細胞進入減數(shù)分裂前期中的細線期。緊接著細胞內(nèi)的同源染色體兩兩配對，為偶線期（圖版Ι-2）。染色體繼續(xù)縮短變粗，即進入粗線期，在此期間，四分體中的姐妹染色單體之間發(fā)生了DNA片段的交換，導(dǎo)致其父本和母本之間遺傳信息的互換，導(dǎo)致基因重組。隨后細胞中發(fā)生交叉的染色單體開始分開，進入雙線期（圖版Ι-3）。染色單體分開后，染色體變成緊密凝集的狀態(tài)向核四周靠近。核膜、核仁消失，紡錘體形成，進入終變期（圖版Ι-4）。之后小孢子母細胞進入減數(shù)分裂中期I（圖版Ι-6），該時期中各成對的同源染色體雙雙移向細胞中央的赤道板，著絲點依次成對排列在赤道板兩側(cè)。在紡錘體的牽引下，成對的同源染色體各自發(fā)生分離，分別移向兩極，即后期（圖版Ι-8）。到達兩極的同源染色體又凝聚起來，核膜、核仁重新出現(xiàn)，細胞分裂進入末期（圖版Ι-9），此時細胞質(zhì)不分裂，形成一個雙核細胞。這個雙核細胞中每個細胞核染色體數(shù)目只有原來母細胞的一半。有雙核的細胞緊接著發(fā)生第二次減數(shù)分裂，進入減數(shù)第二次分裂前期（圖版Ι-10），細胞中兩個核附近的染色體散亂分布，隨后再次凝聚，核膜、核仁再次消失，紡錘體形成。接著染色體著絲點排列到細胞中央的赤道板上，即減數(shù)第二次分裂中期（圖版Ι-12）。其染色體形態(tài)和減數(shù)分裂中期I大致相同，但不存在同源染色體。之后每條染色體著絲點分離，兩條姐妹染色單體分開，成為兩條染色體。它們在紡錘絲的牽引下移向細胞的兩極，即后期（圖版Ι-14），末期核膜、核仁重新出現(xiàn)，到達兩極的染色體分別進入兩個子細胞。

2.2 黃花煙草雄配子體發(fā)育過程

減數(shù)第二次分裂后，四核細胞最初被共同的胼胝質(zhì)包圍，隨著細胞板的形成，四核細胞發(fā)生胞質(zhì)分裂，小孢子四分體形成，在3種煙草中都觀察到十字交叉型（圖版Ι-16）、左右對稱型（圖版Ι-17）和正四面體型（圖版Ι-18）的四分體，3種煙草小孢子四分體的3種排列形式的頻率統(tǒng)計見表1。剛釋放出來的小孢子細胞壁較薄、富含原生質(zhì)、核居中、無萌發(fā)孔，即單核居中期（圖版Ι-21）。隨著小孢子的繼續(xù)發(fā)育，由解體絨氈層供給其營養(yǎng)，小孢子細胞壁逐漸增厚，出現(xiàn)中央液泡，單核被液泡推向細胞邊緣，出現(xiàn)3個萌發(fā)孔，即單核靠邊期（圖版Ι-22）。此時細胞原生質(zhì)濃厚，細胞分裂更加旺盛，緊接著小孢子進行有絲分裂，形成一個較大的營養(yǎng)細胞和一個較小的生殖細胞，即二核靠邊期（圖版Ι-23）。其中營養(yǎng)細胞內(nèi)富含淀粉、脂類等物質(zhì)，為花粉管的萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。即煙草的單核小孢子通過先進行1次正常的非均等分裂，然后通過營養(yǎng)細胞反復(fù)分裂的發(fā)育途徑進行發(fā)育[12]。由于壁物質(zhì)的不均等加厚，此時整個花粉粒外壁形成一個弓形隔壁，不久弓形壁消失，發(fā)育為成熟花粉粒（圖版Ι-24），此時花粉內(nèi)營養(yǎng)核和生殖細胞占據(jù)大部分體積，在后期花粉內(nèi)將積累淀粉粒和脂肪。

2.3 煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象

對3種煙草的小孢子發(fā)生發(fā)育過程觀察結(jié)果表明：3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程基本正常，但少數(shù)細胞中出現(xiàn)了染色體橋、染色體滯后、不同步和微核等異?，F(xiàn)象，不同種煙草出現(xiàn)異常類型和比率有差異。

2.3.1 染色體橋 染色體橋是由于正常的染色體同倒位染色體之間發(fā)生交叉互換，使配子染色體上某一區(qū)段缺失或重復(fù)，導(dǎo)致子代出現(xiàn)異常性狀。對栽培煙草K326的小孢子發(fā)育過程觀察后發(fā)現(xiàn)，少數(shù)細胞在其減數(shù)第一次分裂后期Ⅰ出現(xiàn)染色體橋（圖版Ⅱ-9），出現(xiàn)染色體橋的細胞占有絲分裂細胞總數(shù)的0.05%（表2），黃花煙草和殘波煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程未觀察到染色體橋出現(xiàn)。

2.3.2 染色體滯后 染色體滯后是由于受外界環(huán)境的影響，少數(shù)染色體不能進一步分裂，在同一有絲分裂中期或后期以染色單體的形式表現(xiàn)出來。在對黃花煙草、栽培煙草、殘波煙草3個煙草種小孢子減數(shù)第一次分裂中期（圖版Ⅰ-7；圖版Ⅱ-7；圖版Ⅲ-8）和減數(shù)第二次分裂中期（圖版Ⅰ-13；圖版Ⅱ-14；圖版Ⅲ-14）的觀察中發(fā)現(xiàn)，3種煙草均出現(xiàn)個別染色體滯后的現(xiàn)象，3種所觀察出現(xiàn)的概率統(tǒng)計分別為0.1%、0.05%、0.07%（表2）。

2.3.3 微核 微核（micronucleus，MCN）是出現(xiàn)在主核旁邊體積通常小于主核1/3的小核，它是真核類生物細胞中染色體畸變形成的一種異常結(jié)構(gòu)。在本實驗中觀察到在殘波煙草小孢子發(fā)育四分體時期有微核的出現(xiàn)（圖版Ⅲ-11、16），出現(xiàn)微核的細胞比率為0.08%（表2）。初步推測殘波煙草微核的形成有兩方面的原因：一可能是殘波煙草小孢子在減數(shù)分裂時期，由于分裂間期產(chǎn)生的染色體斷片在分裂過程中不能與正常染色體協(xié)同活動，在進入分裂期時，被排斥在主核周圍形成不規(guī)則的染色質(zhì)團（圖版Ⅲ-5），占統(tǒng)計細胞比率為7%（表2）。有的染色體質(zhì)團會被包埋在主核內(nèi)（圖版Ⅲ-4），所占細胞比率統(tǒng)計為：0.8%（表2）。隨后發(fā)育成微核。二則可能是減數(shù)分裂過程中形成的滯后染色體在分裂末期形成微核。出現(xiàn)微核的細胞普遍出現(xiàn)細胞質(zhì)著色淺、透光性較強，而且細胞核體積縮小，染色質(zhì)染色較深，染色質(zhì)呈現(xiàn)部分或者全部凝集。其他兩個煙草品種有滯后染色體出現(xiàn)，卻未發(fā)現(xiàn)有微核的形成，可能是所觀察的細胞數(shù)量不足。

2.3.4 減數(shù)分裂節(jié)奏高度不同步 在對3種煙草小孢子壓片觀察后發(fā)現(xiàn)：小孢子發(fā)育不同步包括同一花藥的不同花粉囊中發(fā)育時期不同以及同一花粉囊中不同小孢子分裂的進程也不一致（圖版Ⅰ-25；圖版Ⅱ-21；圖版Ⅲ-21），一張制片上往往能觀察到3～5個分裂相，在殘波煙草的小孢子減數(shù)分裂過程中發(fā)現(xiàn)，同一視野中出現(xiàn)了減數(shù)第二次分裂間期的小孢子母細胞和已經(jīng)發(fā)育成熟的花粉粒；小孢子發(fā)育不同步還包括同一細胞中染色體步調(diào)不一致，如在殘波煙草減數(shù)第二次分裂中后期同一細胞中2組染色體步調(diào)不一致（圖版Ⅲ-15）。

3 討論

3.1 3種煙草小孢子發(fā)育的異同及其意義

本研究通過對3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程的觀察發(fā)現(xiàn)：3種煙草小孢子的發(fā)生均從孢原細胞開始，經(jīng)過造孢細胞、小孢子母細胞、四分體、小孢子和單核花粉粒等發(fā)育階段，最后形成二核花粉。胞質(zhì)分裂為同時型，小孢子四分體排列有十字交叉型、正四面體型和左右對稱型，成熟的花粉粒包含一個較大的營養(yǎng)核和一個較小的生殖核。這與Sunderland[12]對芍藥屬、大麥屬、煙草屬和曼陀羅屬等植物的觀察并提出了二型花粉的假設(shè)基本一致。也符合Palmer C E[13]早在煙草花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)第1次分裂為不對稱的觀點。以上實驗結(jié)論初步表明3種煙草具有較高的同源性。

3.2 小孢子母細胞減數(shù)分裂的異常與小孢子的育性

3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程類似且發(fā)育過程基本正常，少數(shù)細胞中出現(xiàn)了染色體橋、染色體滯后、微核和染色體不同步現(xiàn)象，但這些異?，F(xiàn)象不影響3種煙草正常的生殖繁育過程。

栽培煙草K326的小孢子發(fā)育過程中觀察到染色體橋，染色體橋在染色體移向兩極進入子細胞時被拉斷，斷片不能進入子細胞的核內(nèi)，在分裂的后期可能形成微核導(dǎo)致小孢子不育。殘波煙草小孢子發(fā)育四分體時期少數(shù)細胞中有微核出現(xiàn)，這部分細胞通常有較密集的核固縮，無法進行正常的有絲分裂，導(dǎo)致細胞早期凋亡，形成不可育的配子。有研究表明生活污水中的有機物及各種毒害成分誘發(fā)蠶豆微核率顯著增加[14]。推測殘波煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過程較其他兩個種小孢子發(fā)育更易受外界環(huán)境條件影響。

3種煙草均在不同比率的細胞中觀察到滯后染色體，滯后染色體成因可能是由于雜種起源的植物物種，根據(jù)兩親本的親緣關(guān)系遠近而表現(xiàn)出不同的異質(zhì)性，引起染色體間同源性表現(xiàn)差異，導(dǎo)致減數(shù)分裂過程表現(xiàn)出異常[15]；另外，外界環(huán)境的改變也會導(dǎo)致滯后染色體的產(chǎn)生，有研究表明在pH與Al的作用下，細胞會出現(xiàn)滯后染色體導(dǎo)致減數(shù)分裂畸變效應(yīng)[16]。染色體落后會使所形成的二分體染色體數(shù)目不相等或不能形成正常的四分體，以致這部分煙草小孢子母細胞在早期或雙核前期發(fā)生敗育現(xiàn)象，這與楊弘遠[17]認(rèn)為雙子葉植物小孢子敗育大都偏早的觀點一致。

3種煙草小孢子均出現(xiàn)減數(shù)分裂高度不同步現(xiàn)象，推斷其原因可能是由于減數(shù)分裂進入前期Ι、中期Ι時，花粉母細胞的初始細胞壁便完全消失，同時形成胼胝質(zhì)壁使細胞間的聯(lián)系消失，并且胼胝質(zhì)壁的形成也不同步，結(jié)果每個小孢子母細胞在孤立的環(huán)境中進行減數(shù)分裂，細胞的個體差異得到充分體現(xiàn)。這是花藥內(nèi)部發(fā)育協(xié)調(diào)性差異的表現(xiàn)，是一種比較原始的特性[18]。這種特性可以延長花期，增加兩性功能相互作用的時間，對于其物種的繁衍具有重要的意義[15]，但也可能導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常。

針對小孢子雄核發(fā)生發(fā)育的細胞生物學(xué)研究對煙草生殖生物和遺傳育種具有重要的指導(dǎo)意義，但今后還應(yīng)該從生理學(xué)和遺傳學(xué)等角度，考慮基因型[19]、絨氈層[20]、低溫[21]等很多內(nèi)外因素對小孢子發(fā)生發(fā)育的影響，以更全面科學(xué)的指導(dǎo)煙草的栽培育種實踐。

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