辛穎 奧烏力吉 王麗梅 趙麗

【摘 要】 目的 本研究擬在內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的蒙古族人群中驗(yàn)證血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）受體2（KDR）基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)。方法 研究對(duì)象為2010年1月至2011年10月通遼市疾病預(yù)防控制中心收集的400例樣本，其中包括200例健康的蒙古族對(duì)照人群和200例蒙古族冠心病患者。采用PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化的方法對(duì)目的基因進(jìn)行分型，并通過(guò)抽樣測(cè)序以驗(yàn)證PCR-酶切方法的準(zhǔn)確性。ELISA方法檢測(cè)血漿中KDR的水平。結(jié)果 KDR的3個(gè)SNP位點(diǎn)均與蒙古族冠心病的易感度相關(guān)，其中SNP-604的OR=1.45（P<0.05），SNP1192的OR=1.42（P<0.05），SNP1719的OR=1.49（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示SNP-604CC基因型攜帶者血漿中KDR蛋白水平顯著低于SNP-604TT基因型攜帶者。與對(duì)照組相比，冠心病組KDR蛋白水平表達(dá)增加，與CRP表達(dá)水平成正比。結(jié)論 KDR的SNP-604、SNP1192和SNP1719與蒙古族冠心病遺傳易感性相關(guān)，其作用機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié)KDR的表達(dá)去影響KDR與VEGF結(jié)合率。

【關(guān)鍵詞】 KDR；變異；冠心??；蒙古族

【中圖分類號(hào)】 R541.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

冠心病的發(fā)生是多種危險(xiǎn)因素長(zhǎng)期相互作用的共同結(jié)果。在冠心病的各個(gè)發(fā)病學(xué)說(shuō)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)幾乎均有涉及，它被認(rèn)為是冠心病發(fā)病進(jìn)程中最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體系統(tǒng)在血管生成和內(nèi)皮損傷修復(fù)過(guò)程中起到非常重要的作用[2]。KDR作為2型VEGF受體，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中，與VEGF結(jié)合后主要在血管的生成和修復(fù)中起關(guān)鍵作用。有研究顯示，VEGF及KDR參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的全過(guò)程[3]。我們通過(guò)查找相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)KDR基因上含有多個(gè)SNP位點(diǎn)，通過(guò)生物信息學(xué)提示得出某些SNP位點(diǎn)可能影響蛋白分子VEGFR2的表達(dá)情況及功能，即KDR的基因多態(tài)性可能與冠心病的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。我們選取KDR基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)SNP-604以及編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)SNP1192和SNP1719，旨在研究這些SNP位點(diǎn)在蒙古族冠心病患者的個(gè)體遺傳易感度。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 樣本的入選 病例-對(duì)照人群樣本來(lái)源于通遼市疾病預(yù)防控制中心在2010年1月至2011年10月收集的200例蒙古族冠心病患者和200例蒙古族健康對(duì)照。入選標(biāo)準(zhǔn)包括冠心病患者均通過(guò)冠狀動(dòng)脈造影檢查確認(rèn)，至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50%。對(duì)照組人群的冠狀動(dòng)脈狹窄沒(méi)有超過(guò)20%，并且沒(méi)有其他的血管性疾病。

1.1.2 問(wèn)卷調(diào)查和血標(biāo)本采集 經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的工作人員對(duì)每一位冠心病患者和健康對(duì)照人群進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷調(diào)查，由本人或家庭成員接受問(wèn)卷調(diào)查。問(wèn)卷調(diào)查的內(nèi)容主要包括被調(diào)查者的飲食、生活習(xí)慣（包括是否吸煙、飲酒等）、高血壓史及服降壓藥史、神經(jīng)疾病史、糖尿病史等。經(jīng)過(guò)詳細(xì)的體征測(cè)量后，取尿和空腹血，檢測(cè)相關(guān)的生化指標(biāo)。

1.2 基因測(cè)定 采用PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化的方法檢測(cè)各樣本KDR的SNP位點(diǎn)。詳細(xì)信息見表1。

1.3 ELISA方法檢測(cè)血漿KDR蛋白水平 為了分析KDR基因的SNP-604位點(diǎn)對(duì)血漿KDR水平是否有影響，本研究隨機(jī)選擇24個(gè)健康對(duì)照的血漿，使用ELISA方法檢測(cè)血漿中KDR蛋白的濃度。24個(gè)樣本的基因型分別是8個(gè)TC，8個(gè)TT，8個(gè)CC。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，顯著性水平P值定為0.05（雙側(cè)）。計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；計(jì)數(shù)資料用事件的比例表示，采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用卡方檢驗(yàn)評(píng)價(jià)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；計(jì)算所有SNPs的等位基因頻率和基因型頻率在病例組和對(duì)照組的分布，并進(jìn)行每個(gè)SNP位點(diǎn)的單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析；采用多因素Logistic回歸模型調(diào)整傳統(tǒng)的心血管危險(xiǎn)因素后分析不同基因型與冠心病的關(guān)聯(lián)，并計(jì)算出調(diào)整后的相對(duì)危險(xiǎn)度和95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 人群一般臨床資料 病例-對(duì)照人群的主要臨床資料如表2所示，在蒙古族的冠心病樣本中患糖尿病、患高血壓以及吸煙等指標(biāo)均明顯高于健康對(duì)照組（P<0.01）。

2.2 ELISA方法檢測(cè)血清KDR蛋白水平 應(yīng)用ELISA分析方法得出SNP-604CC基因型攜帶者血清中KDR蛋白水平顯著低于SNP-604TT。結(jié)果見表3。

2.3 KDR基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率與冠心病的關(guān)聯(lián)分析 KDR的基因型頻率分布見表4，均符合Hardy-Weinberg平衡。通過(guò)統(tǒng)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)KDR的3個(gè)SNP位點(diǎn)，當(dāng)只攜帶一個(gè)危險(xiǎn)等位基因型時(shí)，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于不攜帶危險(xiǎn)等位基因的人，但是與攜帶2個(gè)危險(xiǎn)等位基因的純合子相比，又無(wú)明顯差異，提示目前存在著顯性遺傳效應(yīng)。當(dāng)采用顯性模型來(lái)分析這3個(gè)SNP位點(diǎn)與蒙古族冠心病的關(guān)聯(lián)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在冠心病病例組中，所有這3個(gè)SNP的攜帶危險(xiǎn)等位基因的純合子基因型和雜合子基因型頻率均顯著高于正常對(duì)照組，利用多因素Logistic回歸模型對(duì)年齡、性別、吸煙、飲酒等危險(xiǎn)因素進(jìn)行校正以后，這種相關(guān)性依然存在。

對(duì)SNP-604：M=T，m=C；對(duì)SNP1192：M=G，m=A；對(duì)SNP1719：M=T，m=A

3 討論

病例-對(duì)照研究結(jié)果顯示KDR基因3個(gè)SNP位點(diǎn)SNP-604、SNP1192、SNP1719均與蒙古族冠心病的遺傳易感度相關(guān)。在校正一些傳統(tǒng)的冠心病危險(xiǎn)因素后，這3個(gè)SNP與蒙古族患冠心病的相關(guān)性依然存在，說(shuō)明這3個(gè)SNP位點(diǎn)可以作為蒙古族冠心病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，即攜帶突變型等位基因的蒙古族具有更高的冠心病遺傳易感性。

內(nèi)皮細(xì)胞損害或者功能障礙可以導(dǎo)致冠心病的發(fā)生，體內(nèi)異常血管的生成亦可增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。VEGF和KDR通過(guò)很多作用機(jī)制去參與影響冠心病的發(fā)病過(guò)程[5]。本研究中關(guān)于KDR基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)，其基因型的頻率分別與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。KDR基因SNP-604T>C可以下調(diào)KDR的mRNA水平，進(jìn)而降低血清中KDR蛋白的水平。SNP1192G>A和SNP1719T>A位點(diǎn)均可以影響VEGF與KDR的結(jié)合效率，使其結(jié)合量少，結(jié)合效率低。通過(guò)本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推測(cè)KDR功能活性的降低與血管功能障礙有關(guān)（如內(nèi)皮細(xì)胞損傷、異常的血管修復(fù)等），可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

4 結(jié)論

KDR基因上的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)SNP-604、SNP1192和SNP1719通過(guò)影響KDR的表達(dá)和功能，與蒙古族患冠心病的遺傳易感度相關(guān)，這可作為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病新的遺傳危險(xiǎn)標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

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