張秀英 宋瑞清 理永霞等

摘要[目的] 研究潰瘍病菌誘導(dǎo)下毛白楊防御相關(guān)基因的應(yīng)答反應(yīng)。[方法] 以毛白楊為試驗(yàn)材料，用潰瘍病菌對(duì)7月齡幼苗進(jìn)行接種，提取誘導(dǎo)前后的毛白楊樹(shù)皮mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，構(gòu)建72 h差異表達(dá)的SSHcDNA文庫(kù)。隨機(jī)挑選199個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中序列進(jìn)行比較，并對(duì)這些EST在dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索分析，利用RTqPCR對(duì)文庫(kù)中7個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。[結(jié)果] 172個(gè)EST找到了同源序列，其中有32個(gè)序列與防御相關(guān)。在毛白楊受到潰瘍病菌誘導(dǎo)時(shí)，這些防御基因的表達(dá)量明顯上升。[結(jié)論]該研究為開(kāi)展毛白楊抗?jié)儾≈匾δ芑虻目寺『丸b定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞毛白楊；葡萄座腔菌；防御相關(guān)基因；抑制性消減cDNA文庫(kù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)S763.13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03555-04

基金項(xiàng)目林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204501）；中國(guó)林科院院部基金（CAFYBB2011005-4）；科技部基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2009FY210100）。

作者簡(jiǎn)介張秀英（1977-），女，山東平原人，講師，在讀博士，從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事森林病理學(xué)研究。

楊樹(shù)潰瘍病是一種慢性病，主要危害樹(shù)干，分布廣泛，嚴(yán)重影響了楊樹(shù)幼苗及幼樹(shù)的生長(zhǎng)，已成為影響我國(guó)楊樹(shù)人工林發(fā)展的主要因素之一。目前，對(duì)楊樹(shù)-病原相互作用的分子機(jī)制研究主要集中在楊樹(shù)與銹菌[1-2]和楊樹(shù)與楊盤(pán)二孢菌[3]的相互作用研究，而對(duì)楊樹(shù)-潰瘍病菌的相互作用的分子機(jī)制研究較少[4]，從基因組水平上研究病原菌的致病機(jī)理和機(jī)制更少。由于互作系統(tǒng)本身的復(fù)雜性，要探究植物與病原菌互作的響應(yīng)機(jī)制，闡明其中的分子機(jī)理，需要進(jìn)一步深入開(kāi)展關(guān)于基因調(diào)控機(jī)理方面的研究。

Diatchenko等[5]建立以PCR為基礎(chǔ)的差減雜交技術(shù)，具有高靈敏性、目的序列富集程度高、操作簡(jiǎn)便、豐度相對(duì)一致等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)因其顯著特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，已成為差異表達(dá)基因的有效分離方法，迄今為止在林木病害研究中已有許多報(bào)道[6-7]。筆者用潰瘍病高抗品種毛白楊作為試驗(yàn)材料，接種潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）72 h后構(gòu)建cDNA文庫(kù)，同時(shí)利用獲得的EST測(cè)序結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步研究楊樹(shù)樹(shù)皮在潰瘍病菌誘導(dǎo)后的基因表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1植物材料。毛白楊（Populus tomentosa Carr.），高抗樹(shù)種，15年生，感病指數(shù)為0～6.0[8]，生長(zhǎng)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)院內(nèi)，采摘1年生健康枝條，扦插1個(gè)月苗木生根后，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗進(jìn)行定植，幼苗長(zhǎng)至7月齡時(shí)用于試驗(yàn)。

1.1.2 病原菌及接種方法。試驗(yàn)菌株為Botryosphaeria dothidea菌株，菌株號(hào)為CXY001，分離于楊樹(shù)潰瘍病斑，經(jīng)單孢培養(yǎng)鑒定，再回接，以此確認(rèn)致病性（致病力中等），保存于中國(guó)林科院菌種保藏中心。試驗(yàn)前，先將病原菌活化，參考趙仕光等的接種方法并稍加修改[9]。接種72 h后取樣，截取病健交界處0.5 cm×1.0 cm長(zhǎng)條形樹(shù)苗干部樹(shù)皮（帶形成層），約每500 mg樣品用錫鉑紙包成1包后，迅速投入液氮中，于-80 ℃下貯存?zhèn)溆茫▓D1）。對(duì)照采用接種無(wú)菌培養(yǎng)基后72 h取樣。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及mRNA的純化。采用鼎國(guó)公司的植物RNA提取試劑盒提取毛白楊樹(shù)皮的總RNA，使用Plant RNAzol試劑盒提取真菌的總RNA，使用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量測(cè)定，利用Promega公司的mRNA分離純化試劑盒[PolyA Tract SystemsⅢ（Z5300）]分離純化mRNA，通過(guò)電泳檢測(cè)其完整性。

1.2.2 構(gòu)建抑制差減文庫(kù)及重組子的鑒定。利用Clontech公司的抑制性消減雜交文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit）構(gòu)建潰瘍病菌誘導(dǎo)毛白楊72 h的差減文庫(kù)。在試驗(yàn)過(guò)程中以真菌接種處理的楊樹(shù)樹(shù)皮作為試驗(yàn)方（Tester）；參照方（Driver）一部分來(lái)源于培養(yǎng)基處理的楊樹(shù)樹(shù)皮的mRNA，一部分來(lái)源于培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌mRNA（圖2）。將消減雜交反應(yīng)后得到的cDNA與 pMD19T載體連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)化菌涂在含有Amp抗性的LB平板上，37 ℃下培養(yǎng)16 h，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑出陽(yáng)性克隆，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（含有Amp/LB液體培養(yǎng)基），搖床培養(yǎng)。吸取菌液，PCR擴(kuò)增，檢測(cè)插入片段的大小。

注：a.B. dothidea菌誘導(dǎo)毛白楊 72 h，作為試驗(yàn)方；b.培養(yǎng)72 h的菌絲；c.PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)毛白楊72 h。將培養(yǎng)72 h的菌絲與PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h的毛白楊按1∶1（mRNA）的比例混合，作為參照方。

1.2.3 抑制消減雜交文庫(kù)測(cè)序及序列分析。抑制消減雜交文庫(kù)測(cè)序由鼎國(guó)公司完成，將獲得的EST序列進(jìn)行EST前處理，剔除不符合要求的序列，然后遞交NCBI網(wǎng)站，通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST（或者BLASTN）序列比對(duì)工具，在GenBank 的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)EST序列進(jìn)行同源檢索分析。

1.2.4 Realtime PCR定量檢測(cè)。使用7月齡苗木進(jìn)行接種試驗(yàn)。以不接種潰瘍病菌毛白楊苗木作為對(duì)照方，以接種潰瘍病菌的毛白楊作為測(cè)試方，分別于接種后12、24、48、72、96和144 h取樣，剪取對(duì)照和接種材料的樹(shù)皮置于液氮中，-80 ℃下保存?zhèn)溆?。每個(gè)接種時(shí)間處理5株毛白楊，重復(fù)3次。

以EF1α作為內(nèi)參基因，根據(jù)內(nèi)參基因設(shè)計(jì)特異性引物，依此來(lái)設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)及目的基因擴(kuò)增的模板量。使用SYBR GREEN PCR MasterMix（TOYOBO）試劑盒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR，在7500循環(huán)儀（Biorad）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。Realtime PCR 反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Supermix（Qiagen）15 μl、正向和反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析，引物見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1 酶切效果分別取2 μg試驗(yàn)方和參照方的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成雙鏈cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切，結(jié)果表明RsaⅠ酶切后酶切的cDNA 大小范圍明顯小于未酶切的cDNA，說(shuō)明酶切完全，符合試驗(yàn)要求，可以用于差減文庫(kù)的構(gòu)建（圖3）。

2.2文庫(kù)篩選及插入片段大小 RsaⅠ酶切后進(jìn)行接頭連接和2輪雜交，接著進(jìn)行2輪抑制PCR，參照方和試驗(yàn)方的大部分共有序列已被差減消除，不同表達(dá)序列得到進(jìn)一步富集。隨機(jī)挑取100個(gè)克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，其中有95個(gè)存在有效產(chǎn)物?？寺〉牟迦肫未笮》秶鸀?00～500 bp，與SSH預(yù)期插入片段的大小吻合。

2.3抑制差減文庫(kù)差減效率分析經(jīng)2次差減后的內(nèi)參Tub基因，在經(jīng)過(guò)28個(gè)循環(huán)后，隱約可見(jiàn)擴(kuò)增條帶，比未差減對(duì)照（經(jīng)23個(gè)循環(huán)出現(xiàn)清晰的目的條帶）出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的時(shí)間晚，說(shuō)明了經(jīng)過(guò)2次抑制PCR后只保留了試驗(yàn)方受潰瘍病菌侵染后，誘導(dǎo)表達(dá)的基因，試驗(yàn)方和參照方中共同轉(zhuǎn)錄的基因得到了有效扣除（圖4）。

2.5目標(biāo)基因表達(dá)模式的Realtime PCR分析從構(gòu)建的文庫(kù)中選取7個(gè)基因（蛋白），利用實(shí)時(shí)定量PCR分析其在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（12、24、48、72、96 和144 h）的表達(dá)情況。從圖5可以看出，CXY1446、CXY0504、CXY1313和CXY142這4個(gè)基因在潰瘍病菌菌誘導(dǎo)后表達(dá)趨勢(shì)基本一致，即誘導(dǎo)12 h后表達(dá)水平升高；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，這4個(gè)基因的表達(dá)水平也隨之升高；CXY0112、CXY1804和CXY1727這3個(gè)基因的變化趨勢(shì)基本相同，即在潰瘍病菌菌誘導(dǎo)12 h 后這3個(gè)基因的表達(dá)水平都下降；誘導(dǎo)24 h 后隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，基因表達(dá)量逐漸升高，其中CXY0112基因的表達(dá)水平增加了90倍。

3 討論

抑制差減雜交技術(shù)是從基因組水平研究差異表達(dá)基因的重要方法之一，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物中[10-13]。筆者通過(guò)抑制差減雜交技術(shù)分析了潰瘍病菌誘導(dǎo)毛白楊后基因的表達(dá)情況，從中獲得了一些可能參與防御的候選基因。

在生物體的多種代謝反應(yīng)中，苯丙烷代謝與抗病反應(yīng)有著緊密關(guān)系，而細(xì)胞色素P450恰恰是這個(gè)途徑的關(guān)鍵酶。該研究P450（CXY1804）表達(dá)水平先升后降，誘導(dǎo)24 h后表達(dá)水平持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)，表明在這個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中毛白楊接收了脅迫信號(hào)，對(duì)抗?jié)儾』蜻M(jìn)行調(diào)控。P450可以通過(guò)催化合成與抗病相關(guān)的次生代謝物[14]（如木質(zhì)素和植保素），進(jìn)而產(chǎn)生與病原菌誘導(dǎo)和抗?jié)儾∠嚓P(guān)的基因或物質(zhì)。與病程相關(guān)的另一個(gè)重要的蛋白-幾丁質(zhì)酶與植物抗病原微生物有關(guān)[15]。幾丁質(zhì)酶能夠毀壞病原真菌細(xì)胞壁新沉積的物質(zhì)，以至病原真菌死亡，并刺激了寄主的抗病反應(yīng)，使寄主做出相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)。該研究中CXY0415屬于此類蛋白。幾丁質(zhì)酶還可以與β1，3葡聚糖酶協(xié)同作用，激發(fā)植物多種抗病反應(yīng)，誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)反應(yīng)的產(chǎn)生[16]。該研究中CXY1313屬于此類，其表達(dá)水平一直處于上升趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)潰瘍病菌侵染毛白楊樹(shù)皮時(shí)，β1，3葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶這2種酶共同作用，發(fā)揮了對(duì)病原菌的抵抗，抑制了病原菌的生長(zhǎng)。

肌動(dòng)蛋白（Actin）是真核生物中一種重要的蛋白質(zhì)，大量積累在附著胞形成處，可以阻止病原菌侵入[17-18]。該研究中肌動(dòng)蛋白因子7 （ADF7）（CXY0112）在初始階段表達(dá)水平很低，誘導(dǎo)48 h后表達(dá)逐漸增加，144 h達(dá)到最高，是初始90倍，大量積累，以更好地抵制病原菌侵入。鋅指蛋白（CXY1421）屬于細(xì)胞信號(hào)傳遞基因，可以將潰瘍病菌的誘導(dǎo)信號(hào)傳遞給寄主毛白楊[19]；鈣信使（CXY0504）除了傳遞信號(hào)外，還參與并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，增強(qiáng)Active oxygen的產(chǎn)生，更加有效抵抗外來(lái)病菌的入侵[20-21]。鋅指蛋白和Ca2+作為抗病反應(yīng)信號(hào)，在生物體內(nèi)是相輔相成、相互作用的，互相接受和傳遞信號(hào)。胡豆合酶（CXY0511）是吲哚生物堿合成途徑中注：a.CXY1313；b.CXY1446；c.CXY0504；d.CXY1804；e.CXY1421；f.CXY1727；g.CXY0112。

圖5實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 結(jié)果重要的中間產(chǎn)物，也參與植物的防御反應(yīng)[22]。

植物蛋白酶抑制劑[23-24]已在西紅柿、農(nóng)作物大豆及栗屬植物中被發(fā)現(xiàn)，且防御功能廣泛存在。在毛白楊被潰瘍病菌誘導(dǎo)后，半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CXY1727）的表達(dá)持續(xù)升高，主要是抑制葉片中衰老基因的表達(dá)，間接延長(zhǎng)了寄主毛白楊的壽命，抑制了病原菌的生長(zhǎng)繁殖，反映了蛋白抑制劑在植物防御反應(yīng)中的功能；筆者還發(fā)現(xiàn)Kunitz TI3（CXY1446）抑制劑，在銹菌侵染顫楊和雜交楊中寄主表現(xiàn)出對(duì)銹菌的抗性[25-26]。隨著潰瘍病菌侵入時(shí)間的增長(zhǎng)，此抑制劑的表達(dá)量也迅速增加。

綜上所述，抑制差減雜交技術(shù)是一種高通量檢測(cè)基因差異表達(dá)的方法。該研究獲得了一些防御的候選基因，為今后研究楊樹(shù)與潰瘍病抗性提供分子依據(jù)，為揭示此類病害發(fā)生的機(jī)理和病菌的侵染機(jī)制具有重要的意義。

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