賀泂杰

摘要[目的]研究高山離子芥CbCBF1基因的耐鹽性功能。[方法]將高山離子芥的愈傷組織在高鹽條件下進(jìn)行時間梯度處理后，采用Real time PCR和Western blot分析CbCBF1在鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)量的變化。[結(jié)果]CbCBF1響應(yīng)高鹽脅迫，并隨著處理時間的不同表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢。[結(jié)論]該方法考察了高山離子芥CbCBF1基因的耐鹽性功能，為高山離子芥CbCBF1基因的的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞CbCBF1；鹽脅迫；表達(dá)

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）14-04175-01

The Preliminary Functional Research on the Salt Tolerance of CbCBF1

HE Jiongjie（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS， Lanhzou， Gansu 730050）

Abstract[Objective] To study salt tolerance function of CbCBF1. [Method] Time gradient processing was taken on the callus of CbCBF1 in extreme condition of high salt. Then the change of transcription expression of CbCBF1 was analyzed under the salt stress by Real time PCR and Western blot. [Result] It was found that CbCBF1 response to salt stress， and the express of CbCBF1 present different trends under the different processing time. [Conclusion] The salt tolerance function of CbCBF1 was investigated， which will provide reference for further development and utilization of CbCBF1.

Key words CbCBF1； High salt stress； Expression

低溫誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子CBF，CBF屬于DNA結(jié)合蛋白AP2/ERF家族，該家族成員均含有AP2 DNA結(jié)合域[1]。CBF誘導(dǎo)蛋白可以和下游COR基因啟動子中的CRT BOX相結(jié)合，誘導(dǎo)COR基因的表達(dá)，同時也能誘導(dǎo)一些生物合成酶基因的表達(dá)[2-4]。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CBF調(diào)控的基因參與多種生理生化反應(yīng)，如磷酸肌醇代謝和轉(zhuǎn)錄、活性氧清除物轉(zhuǎn)運(yùn)、激素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些活動普遍發(fā)生在植物抗逆應(yīng)答的過程中[5-6]。

高山離子芥是一種生活在天山冰川附近的植物，其生活環(huán)境海拔較高，氣候干燥、寒冷，具有較強(qiáng)的紫外線照射。雖然高山離子芥具有發(fā)達(dá)的通氣組織和厚壁組織，但其依然不具備典型的抗逆特征。因此其能夠在這一環(huán)境極端惡劣地區(qū)較好的生長和發(fā)育，一定與其體內(nèi)特殊的分子信號傳導(dǎo)機(jī)制密不可分[7]。筆者對高山離子芥CbCBF1進(jìn)行研究，以期在非模式植物中對CBF1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深層次的認(rèn)識，為后續(xù)研究該基因所介導(dǎo)的信號通路，利用基因工程技術(shù)綜合改良作物和園藝植物的抗逆性提供一種全新而有效的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1材料 載體和RNA提取試劑盒，由Tiangen公司生產(chǎn)；CbCBF1的cDNA全長序列，由實(shí)驗室通過抑制性消減雜交和RACE技術(shù)獲得；CbCBF1純化蛋白和兔抗，由實(shí)驗室提供。

1.2方法

浮組織總蛋白并測定總蛋白濃度。以離子芥懸浮組織的總蛋白作為內(nèi)參。將不同時間梯度下的總蛋白依照一定上樣量做SDS-PAGE膠檢測；并借助生物學(xué)分析軟件image J對調(diào)整好的內(nèi)參做灰度分析，求得相應(yīng)灰度值。借助Western-blot技術(shù)分別研究不同處理組中離子懸浮組織CbCBF1蛋白的表達(dá)。曝光顯影后做灰度分析，得到CbCBF1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1鹽處理對CbCBF1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)性 實(shí)時熒光定量PCR的結(jié)果表明，鹽處理對于CbCBF1基因相對mRNA含量影響較大，1～6 h CbCBF1基因的相對mRNA含量處于不斷上升和降低的震蕩期，在鹽處理12 h以后CbCBF1基因的相對mRNA含量具有明顯的上調(diào)，在鹽處理48 h時，CbCBF1基因的相對mRNA含量上調(diào)倍數(shù)達(dá)到10倍以上，72 h卻有出現(xiàn)明顯的下降，說明離子芥CbCBF1基因?qū)}脅迫較為敏感（圖1）。

圖1鹽脅迫處理下，離子芥CbCBF1基因相對mRNA含量的變化2.2鹽處理對CbCBF1翻譯水平的調(diào)節(jié)性 Western-blot技術(shù)結(jié)果顯示，CbCBF1蛋白的表達(dá)量在1～12 h均呈現(xiàn)出下降趨勢，但整體維持在一個相對穩(wěn)定的水平下，24 h開始上升，在48 h時時表達(dá)量則上調(diào)至最高點(diǎn)，72 h稍有回落，但仍然維持在一個較高的水平，說明CbCBF1在（圖2）。

3結(jié)論與討論

試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過鹽處理后，CbCBF1基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)量均具有顯著的變化，說明CbCBF1參與高山離子芥耐鹽相關(guān)信號通路，響應(yīng)鹽脅迫。鹽處理下，CbCBF1基因在前48 h內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)趨勢相似，表明CbCBF1基因在響應(yīng)鹽脅迫的信號通路中可能作為次級信號。高山離子芥懸浮組織在150 mmol/L NaCl鹽環(huán)境下隨著時間會逐漸發(fā)白，鹽處理72 h時提取的總蛋白濃度極低；而

圖2鹽脅迫處理下離子芥CbCBF1蛋白表達(dá)量變化趨勢及灰度分析圖CbCBF1蛋白的表達(dá)量卻依然在很高的水平。這說明CbCBF1基因可能參與細(xì)胞凋亡及組織壞死的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[8]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年參考文獻(xiàn)

[1] BADAWI M，DANYLUK J，BOUCHO B，et al.The CBF gene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cereal CBFs[J].Mol Genet Genomics，2007，277：533-554.

[2] GILMOUR S J，F(xiàn)OWLER S G，THOMASHOW M F.Arabidopsis transcriptional activators CBF1，CBF2，and CBF3 have matching functional activities[J].Plant Mol Biol，2004，54：767-781.

[3] GILMOUR S J，SEBOLT A M，SALAZARM P.Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcript ional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J].Plant Physiol1，2000，24（4）：1854-1865.

[4] STEPONKUS P L.A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat[M].London：JAI Press，1993：211-312.

[5] STOCKINGER E J，MAO Y，REGIER M K.Transcriptor adaptor and histone acetyltransferase proteins in Arabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activator involved in cold-regulated gene expression[J].Nucleic Acid Res，2000，29：1524-1533.

[6] STOCKINGER E J，GILMOURS S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the Crepeat/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：1035-1040.

[7] VOGEL J T，ZARKA D G，VAN BUSKIRK H A，et al.Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis[J].Plant J，2005，41：195-211.

[8] GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold induced COR gene expression[J].Plant J，1998，16：433-442.