張榮等

摘 要 為了更深入理解荔枝霜疫霉在果園內(nèi)侵染流行規(guī)律，利用植物病理學方法，通過離體培養(yǎng)研究了環(huán)境因素對荔枝霜疫霉游動孢子釋放、萌發(fā)及卵孢子萌發(fā)的影響。結果表明，在荔枝果肉培養(yǎng)基中，孢子囊萌發(fā)的溫度等于或小于孢子囊形成的溫度時，孢子囊主要以釋放游動孢子的方式萌發(fā)，28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊釋放游動孢子的臨界溫度。荔枝霜疫霉在荔枝果肉培養(yǎng)基中，于26 ℃下培養(yǎng)7 d后，游動孢子釋放最適溫度范圍為12～20 ℃，最適pH值為5～7；游動孢子萌發(fā)的最適溫度為20～24 ℃，最適pH值為7～9；孢子囊在水滴中才釋放游動孢子，游動孢子在水滴中方可萌發(fā)。荔枝霜疫霉在荔枝果皮和葉片煎汁培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生卵孢子。當溫度為28 ℃，pH值為5，12 h光暗交替光照時，卵孢子的萌發(fā)率最高，可達到49.68%；溫度是影響孢子囊萌發(fā)和萌發(fā)方式的主要因素，水是游動孢子釋放和萌發(fā)的必要條件。卵孢子廣泛存在于果園中，為翌年初侵染源；荔枝霜疫霉主要以游動孢子再次侵染寄主。

關鍵詞 荔枝霜疫霉； 游動孢子； 卵孢子； 生物學特性

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Biological Characteristics of Zoospore

and Oospore of Peronophythora litchii

ZHANG Rong1，CHEN Junqiao1，JIANG Zide2，CHEN Houbin1

1 College of Horticulture，South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，Chiana

2 Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control，

South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，Chiana

Abstract In order to understand how Peronophythora litchii spread in litchi orchard， the biological characteristics of zoospore and oospore germination were investigated in vitro by phytopathological research methods. Different means of germination by sporangia were determined by using temperature gradients. If the germinating temperature of sporangia was equal to or below the culture temperature， the sporangia germinated as releasing the zoospores. No zoospores were released if P. litchii was kept at 28 ℃ or higher. When P. litchii was cultured at 26 ℃ on 20% litchi flesh agar， the optimal temperature for zoospore release was 12-20 ℃ and the optimal pH was 5-7. The optimal temperature for zoospore germination was 20-24 ℃ and the pH was 7-9. Release of zoospores by sporangia and germination of zoospores relied on the availability of water. The oospores of P. litchii could generate in a juice medium of the litchi pericarp and leaf. The highest germinating rate of oospores was 49.68% which was achieved under optimal conditions at 28 ℃， pH 5 and 12 h alternating illumination. Oospores throughout the litchi orchard are a source of primary inoculum of P. litchii. Rainfall， night and morning dew in the litchi orchard is conducive to zoospore colonization and infection host.

Key words Peronophythora litchii；Zoospore；Oospore；Biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.023

荔枝霜疫霉病最早于1934年在我國臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)[1]，而后華南農(nóng)學院于1959年在廣東腐爛的荔枝果實上發(fā)現(xiàn)此病害[2]。目前主要分布在中國、泰國、越南、巴布亞新幾內(nèi)亞等國家。荔枝霜疫霉病的病原菌為荔枝霜疫霉（拉丁學名： Peronophythora litchii Chen ex Ko et al）。根據(jù)第8版《真菌字典》[3]，此菌隸屬于假菌界（Chromista）、 卵菌門（Oomycota）、卵菌綱（Oomycetes）、 霜霉目（Peronosporales）、 霜疫霉科（Peronophythoraceae）、 霜疫霉屬（Peronophythora）。該科僅有1屬1種。

荔枝霜疫霉病是發(fā)生在荔枝上非常嚴重的病害，該菌從荔枝抽出花穗到果實成熟至采后貯運整個過程都可造成極大危害，不僅可以為害近成熟的果實，也可為害花序、結果小枝、幼果、果柄。高濕時，嫩葉也可發(fā)病[4]；1995年泰國首次發(fā)現(xiàn)荔枝霜疫霉可以為害5～20年生的Kom和Songkanan荔枝樹根部，引起側(cè)根變褐腐爛，導致樹體死亡[5]。

荔枝霜疫霉生物學特性已有很多研究，但是不同來源菌株生物學特性略有差異。例如Kao等[6]和Chen等[7]認為臺灣地區(qū)的荔枝霜疫霉在V8汁培養(yǎng)基中，菌絲最適生長溫度為24～28 ℃；Liu等[8]認為廣東省的荔枝霜疫霉在PDA淀粉培養(yǎng)基中，菌絲最適生長溫度為28～30 ℃；蔡學清等[9]研究福建省荔枝霜疫霉在PDA培養(yǎng)基中，菌絲生長最適溫度為24 ℃。可見不同地區(qū)荔枝霜疫霉生長最適溫度有差異。孢子囊萌發(fā)方式各學者意見不一。Kao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)在26 ℃下的孢子囊，放在8～24 ℃下均可萌發(fā)成游動孢子，溫度大于等于26 ℃不能釋放游動孢子。然而在16 ℃培養(yǎng)的孢子囊，經(jīng)4～12 ℃冷處理下均可萌發(fā)成游動孢子，溫度大于16 ℃無游動孢子釋放。蔡學清等[10]研究認為培養(yǎng)基、光照、菌齡和溫度均影響孢子囊萌發(fā)方式。關于pH值對荔枝霜疫霉菌絲生長已有多人報道[6-10]，而pH值對荔枝霜疫霉游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)未見報道。對于同宗配合荔枝霜疫霉而言，有性生殖產(chǎn)生的卵孢子抗逆性非常強，在土壤和病殘體上越冬，是病害流行主要初侵染源。僅見Pao[11]等報道了卵孢子的萌發(fā)方式，關于營養(yǎng)成分對卵孢子產(chǎn)生的影響、卵孢子萌發(fā)的影響因素未見報道。

荔枝霜疫霉在果園侵染菌態(tài)為孢子囊和游動孢子，越冬形態(tài)為卵孢子，但有關環(huán)境因子對游動孢子釋放及萌發(fā)，卵孢子的萌發(fā)等相關研究國內(nèi)外鮮有報道。本文就此方面進行了研究，為探索荔枝霜疫霉的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和利用農(nóng)業(yè)措施控制該病害提供理論依據(jù)，并為研究荔枝霜疫霉有性生殖生物學和遺傳變異奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：荔枝霜疫霉，從高州市根子鎮(zhèn)白糖罌果實上分離。

供試培養(yǎng)基及配方：分別稱取200 g荔枝果肉、荔枝果皮、荔枝新葉、荔枝老葉、龍眼果皮、胡蘿卜，用榨汁機絞碎，雙層紗布過濾后，定容至1 000 mL，加入13 g瓊脂粉配制成固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 孢子囊形成溫度及其萌發(fā)溫度對游動孢子釋放的影響 將荔枝霜疫霉在荔枝果肉培養(yǎng)基中分別于16、20、26、28、30 ℃下培養(yǎng)7 d后，用無菌水將不同溫度下生長的霜疫霉迅速配成濃度約為15個孢子囊/視野（100倍）孢子囊懸浮液。將各種孢子囊懸浮液滴于凹玻片上，再分別置于12、16、20、24、26、28 ℃溫度下黑暗培養(yǎng)2 h后，迅速滴入10 μL曲利苯藍染色劑固定，統(tǒng)計游動孢子釋放率。

1.2.2 環(huán)境因子對霜疫霉游動孢子釋放的影響 將荔枝霜疫霉在荔枝果肉培養(yǎng)基中于26 ℃下培養(yǎng)7 d后，用無菌水迅速配成濃度約為15個孢子囊/視野（100倍）孢子囊懸浮液。將孢子囊懸浮液滴于凹玻片上，置于設定的條件下黑暗培養(yǎng)2 h后，迅速滴入10 μL曲利苯藍染色劑固定，統(tǒng)計游動孢子釋放率。每次檢查10個視野，約150個孢子囊，重復3次。

設置試驗溫度分別為12、16、20、24、28 ℃ 5個處理；用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制pH分別為3、5、7、9、11的水溶液；在密閉容器內(nèi)用不同鹽的飽和溶液調(diào)制成空氣相對濕度分別為66%、75%、81%、90%、93%、98%，以水滴為100%濕度，置于20 ℃下培養(yǎng)[12]。

1.2.3 環(huán)境因子對霜疫霉游動孢子萌發(fā)的影響 用無菌水迅速配成濃度約為15個孢子囊/視野（100倍）孢子囊懸浮液，置于16 ℃黑暗培養(yǎng)2 h后，用孔徑為20 μm的濾膜過濾混合液，即可除去孢子囊，配制得到游動孢子懸浮液。將游動孢子懸浮液與荔枝果皮液體培養(yǎng)基等體積混合滴于凹玻片上，分別置于設定的條件下黑暗培養(yǎng)1 h，滴入10 μL曲利苯藍染色劑固定，統(tǒng)計游動孢子萌發(fā)率。每次檢查10個視野，約150個孢子囊，重復3次。

試驗設置的溫度、pH值和濕度同上。

1.2.4 不同培養(yǎng)基對霜疫霉卵孢子產(chǎn)生的影響 參照鄭小波[13]等的方法，略加改進。將5 mm大小的菌碟置于不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基平板（15 mL培養(yǎng)基/皿，直徑9 cm）中，用parafilm膜密封培養(yǎng)皿，黑暗培養(yǎng)30 d。以接種點為中心，在2 cm×2 cm正方形的四個角分別切取4塊大小為0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，壓片，于100倍視野下隨機觀察10個視野內(nèi)卵孢子量，計算平均值。重復3次。

1.2.5 霜疫霉卵孢子獲取方法 將霜疫霉培養(yǎng)在胡蘿卜固體培養(yǎng)基中，置于26 ℃下60 d后，將培養(yǎng)基塊（3 cm×l cm）放到滅菌的小燒杯中，加10 mL無菌水，用高速勻漿機（9 500 r/min）勻漿1.5 min，勻漿液經(jīng)孔徑76、54 μm篩網(wǎng)過濾，濾液用15 mL離心管收集，置于-20 ℃冰箱中7 h后，再3 500 r/min離心2 min富集，獲得卵孢子懸浮液，置-4 ℃冰箱中備用[14-15]。

1.2.6 環(huán)境條件對荔枝霜疫霉卵孢子萌發(fā)的影響 參照左豫虎[16]等的方法，略加改進。將滴有卵孢子懸浮液的水瓊脂培養(yǎng)皿分別置于12、16、20、24、28、32 ℃ 6個不同溫度下；用0.1 mol/L檸檬酸、0.2 mol/L磷酸鹽、0.1 mol/L鹽酸、0.05 mol/L硼砂、0.1 mol/L氫氧化鈉配制pH分別為3、5、7、9、11的水瓊脂培養(yǎng)基；設置連續(xù)黑暗、連續(xù)光照、12 h光暗交替光照的條件；觀察卵孢子的萌發(fā)狀況，計算萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

以上試驗數(shù)據(jù)均采用鄧肯氏新復極差法（DMRT）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對霜疫霉孢子囊釋放游動孢子的影響

荔枝霜疫霉孢子囊不同溫度下釋放游動孢子與孢子囊形成溫度有關。由表1可知，當孢子囊萌發(fā)的溫度≤孢子囊形成的溫度時，孢子囊就會以釋放游動孢子的方式萌發(fā)。在16 ℃下培養(yǎng)形成的孢子囊，當溫度>16 ℃時，在2 h內(nèi)沒有釋放游動孢子；在20 ℃下培養(yǎng)形成的孢子囊，所置溫度>20 ℃時，在2 h內(nèi)沒有釋放游動孢子；在28 ℃下培養(yǎng)形成的孢子囊，置于不同溫度下，其游動孢子釋放率隨著溫度升高而降低；在30 ℃下培養(yǎng)形成的孢子囊，置于不同溫度下，均不能釋放游動孢子。28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊釋放游動孢子的臨界溫度。

2.2 溫度對游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)的影響

不同溫度下，游動孢子釋放率和萌發(fā)率有所不同。當溫度為24 ℃時，游動孢子釋放率為63.25%，隨著溫度降低游動孢子釋放率高達85%以上，且在20、16、12 ℃下游動孢子釋放率不存在顯著差異。游動孢子萌發(fā)的最適溫度為24～20 ℃，萌發(fā)率分別為54.46%和51.50%；其次是28 ℃，萌發(fā)率為43.85%；16 ℃以下低溫不利于游動孢子萌發(fā)（見圖1）。

2.3 pH值對游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，當pH值為5時，游動孢子釋放率最高，達89.73%，最適游動孢子釋放的pH值范圍是為5～7。游動孢子萌發(fā)的最適pH值范圍為7～9，游動孢子萌發(fā)率為46.15%～52.11%。

2.4 濕度對游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)的影響

水是霜疫霉游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)的必要條件，研究表明在20 ℃的水滴中，游動孢子的釋放率和萌發(fā)率分別為85.17%和51.50%。相對濕度為98%時，游動孢子的釋放率和萌發(fā)率分別降到9.09%和0。

2.5 環(huán)境因素對卵孢子萌發(fā)的影響 試驗結果表明，供試的6種培養(yǎng)基中，荔枝霜疫霉在胡蘿卜培養(yǎng)基中產(chǎn)生的卵孢子量最多，為102.6個/視野，極顯著高于荔枝煎汁培養(yǎng)基；在荔枝煎汁培養(yǎng)基中，產(chǎn)生卵孢子量由多到少依次為荔枝新葉培養(yǎng)基、荔枝果皮培養(yǎng)基、荔枝老葉培養(yǎng)基；而在荔枝果肉和龍眼果皮培養(yǎng)基中不產(chǎn)生卵孢子（見表2）。

卵孢子作為主要的初侵染源，溫度、pH值、光照對卵孢子的萌發(fā)起著重要的作用。由表2可知，當溫度為28 ℃，pH值為5，12 h光暗交替光照時，卵孢子的萌發(fā)率最高，可達到49.68%。

3 討論

溫度決定孢子囊萌發(fā)方式。當孢子囊萌發(fā)溫度等于或低于孢子囊形成的溫度時，孢子囊主要以釋放游動孢子的方式萌發(fā)，28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊釋放游動孢子的上限溫度。但是，溫度對孢子囊萌發(fā)的影響各學者意見不一，戚佩坤等[4]認為在玉米粉培養(yǎng)基中24 ℃下培養(yǎng)7 d荔枝霜疫霉，當溫度低于24 ℃時，才能以游動孢子的形式萌發(fā)，且萌發(fā)率在8～16 ℃下最高；liu等[8]認為孢子囊萌發(fā)的最適溫度是26～30 ℃；蔡學清等[10]研究表明在24 ℃培養(yǎng)的荔枝霜疫霉，溫度為16～24 ℃時孢子囊萌發(fā)形成游動孢子，在26 ℃以上萌發(fā)形成芽管。上述3篇文章中均未提到孢子囊形成的溫度與孢子囊萌發(fā)時溫度的關系。本研究認為孢子囊形成時的溫度影響其在不同溫度下孢子囊萌發(fā)方式，此觀點與Kao等[9]研究結果相同。當孢子囊萌發(fā)的溫度小于或等于孢子囊形成的溫度時，孢子囊主要以釋放游動孢子的方式萌發(fā)。在果園內(nèi)，隨著降雨的持續(xù)，果園溫度必然降低，孢子囊形成的溫度高于游動孢子釋放的溫度，且低于游動孢子釋放的臨界值28 ℃，進一步證明荔枝霜疫霉在果園內(nèi)主要是釋放游動孢子行再次侵染的。游動孢子釋放的需冷機制在疫霉屬中已有大量研究，普遍認為這種需冷機制受到Ca2+和磷脂的調(diào)控[17]。霜疫霉游動孢子釋放是否與其有關有待于進一步研究。

pH值影響游動孢子釋放和萌發(fā)。本研究認為中性偏酸有利于游動孢子的釋放，而中性偏堿的環(huán)境則會促進游動孢子萌發(fā)。水是霜疫霉游動孢子釋放和游動孢子萌發(fā)的必要條件。游動孢子釋放和萌發(fā)的生物學特性研究表明降雨和雨后荔枝園內(nèi)的環(huán)境、夜晚及早晨的露水均有利于游動孢子的定植和侵染。自然狀態(tài)下，雨水多呈中性，可以通過雨前對荔枝樹噴撒石灰粉，使樹圍雨滴的pH值增大，從而抑制游動孢子的釋放，實踐證明此方法在一定程度上降低了霜疫霉的為害。有學者推測孢子囊和游動孢子需水的萌發(fā)機制，可以解除孢子囊和游動孢子萌發(fā)的抑制物質(zhì)，這種機制的研究將在此類病害田間防治上有重要意義，但是相關研究鮮有報道[18]。

卵孢子作為荔枝霜疫霉初侵染源，本文首次報道了荔枝霜疫霉卵孢子的生物學特性。研究表明卵孢子可以在荔枝葉片、荔枝果皮上形成；當溫度為28 ℃，pH值為5，12 h光暗交替光照時，其萌發(fā)率最高。降低霜疫霉初侵染源的基數(shù)對控制該病害的流行有重要意義。在溫度、降雨、pH值和光照4個因素中，荔枝園內(nèi)的溫度、降雨和光照很難人為控制，只有pH值是可控因素，可以使用樹盤下施用膠體硫、石灰粉等方式改變土壤pH值，降低卵孢子萌發(fā)率；另外，通過農(nóng)業(yè)措施也可以減少初侵染源，比如果園間伐和覆地膜，減少或者阻斷初侵染源萌發(fā)，降低荔枝霜疫霉的為害。

總之，通過離體培養(yǎng)研究環(huán)境因子對荔枝霜疫霉生物學特性的影響有利于更深入理解病害在果園內(nèi)侵染流行，為進一步制定防治措施奠定理論基礎。

參考文獻

[1] Chen C C. A species of Peronophythora gen. nov. parasitic on litchi fruit in Taiwan[J]. Special Public College Agriculture， Natl. Taiwan University， 1961， 10： 1-37.

[2] 中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所. 中國果樹病蟲志[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1960： 568.

[3] Hawksworth D L， Kirk P M， Sutton B C， et al. Ainsworth & Bisbys Dictionary of the fungi 8th[M]. CAB International. 1995.

[4] 戚佩坤， 潘雪萍， 劉 任. 荔枝霜疫霉病的研究. I. 病原菌的鑒定及其侵染過程[J]. 植物病理學報， 1984， 14（2）： 113-119.

[5] Chaiwatana K， Manoch T， Vichai R. et al. Peronophythora litchii associated with root rot of litchi[M]. National Plant Protection Conference， Chiang Mai（Thailand）， 9-11 Oct 1995. Bangkok（Thailand）. 1995： 3-7.

[6] Kao C W， Leu L S. Sporangium germination of peronophythora litchi， the causal organism of litchi downy blight[J]. Mycologia， 1980， 72： 737-748.

[7] Chen L C， Lai S C， Lee C C， et al. Effect of environmental factors on mycelial growth of Peronophythora litchi[J]. Plant Pathology Bulletin， 1998， 7（3）： 128-133.

[8] Liu J， Liu A Y， Chen W X. Studies on the biological characteristics of lychee downy blight[J]. Acta Horticulturae， 2005， 665： 415-420.

[9] 蔡學清， 吳昌鎮(zhèn)， 林 通， 等. 環(huán)境因子對荔枝霜疫霉生長及侵染的影響[J]. 中國農(nóng)學通報， 2010（9）： 283-288.

[10] 蔡學清， 林 娜， 陳 煒， 等. 荔枝霜疫霉的生物學特性[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（9）： 1 226-1 230.

[11] Pao A J， Ko W H. Oospore Germination of Peronophythora Litchii[J]. Mycologia， 1980， 72： 611-614.

[12] 方中達. 植病研究方法[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2001： 344.

[13] 鄭小波， 王源超， 陳慶和，等. 營養(yǎng)條件對同宗配合疫霉菌卵孢子產(chǎn)生量的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學學報， 1996， 19（1）： 26-29.

[14] Banihashemi Z， and Mitchell J E. Factor Affecting Oospore Germination in Phytophthora cactorum， the Incitant of Apple Collar Rot. Ecology and Epidemiology[J]. Phytopathology， 1975， 66： 443-448.

[15] 鄭小波， 陸家云， 方中達. 掘氏疫霉卵孢子萌發(fā)研究[J]. 植物病理學報， 1991， 21（4）： 251-256.

[16] 左豫虎， 臧忠婧， 韓文革，等. 影響大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）卵孢子萌發(fā)的條件[J]. 大豆科學， 2002， 21（2）： 101-105.

[17] Latijnhouwers M， Munni T，Govers， F. Phospholipase D in Phytophthora infestans and its role in zoospore encystment[J]. Molecular Plant Microbe Interact， 2002， 15： 939-946.

[18] Howard S J， Flavio A B. the Spores of Phytophthora： Weapons of The Plant Destroyer[J]. Microbiology， 2005， 3： 47-58.

責任編輯：凌青根