歐陽(yáng)超等

摘 要 為擴(kuò)大橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)外植體來(lái)源和建立高效穩(wěn)定的橡膠樹(shù)葉片離體再生體系，以1年生巴西橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97袋裝苗葉片為材料，研究葉片的預(yù)處理、0.1%升汞不同消毒時(shí)間、離體葉片切取部位、3種激素（6-BA、NAA、2，4-D）不同濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明：用液體培養(yǎng)基MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA對(duì)橡膠樹(shù)袋裝苗葉片進(jìn)行預(yù)處理，可誘導(dǎo)出愈傷組織；用0.1%升汞對(duì)袋裝苗葉片消毒15 min，其存活率達(dá)2.47%，為最佳消毒方法；用含主脈葉塊和含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分進(jìn)行培養(yǎng)所誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)、呈黃綠色，為橡膠袋裝苗葉片培養(yǎng)的最適宜外植體；橡膠袋裝苗葉片最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+ 3 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝膠，用此培養(yǎng)基對(duì)含主脈葉塊和含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分進(jìn)行培養(yǎng)，其出愈率分別達(dá)49.07%和42.22%。結(jié)論：大田1年生橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97袋裝苗葉片經(jīng)預(yù)處理后選擇含主脈葉塊為外植體，可誘導(dǎo)出理想的愈傷組織。

關(guān)鍵詞 熱研7-33-97；袋裝苗；葉片；愈傷組織

中圖分類號(hào) Q813.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Callus Culture From Bagged Seedlings Leaves of

Hevea Brasiliensis Müll. Arg. Clone Reyan 7-33-97

OUYANG Chao1，MO Tinghui1*，ZENG Lixing2

1 College of Agronomy，Hainan University，Haikou 570228，China

2 College of Environmental Sciences and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China

Abstract In order to expand the rubber tree explant sources and to establish efficient and stable rubber tree leaves in vitro regeneration system，the annual bagged seedling leaves of Reyan 7-33-97 were used as the explants to study on the effects of leaves pretreatment，different disinfection time with 0.1% HgCl2，different parts of detached leaves，different combinations of three kinds of phytohormone（6-BA， NAA， 2，4-D）on callus induction frequency，and screen the best subculture medium. The results showed that leaves pretreated with liquid medium MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA could induce callus；leaves disinfected with 0.1% HgCl2 for 15 min was the best disinfection method，its survival ratio could be 2.47%；leaves（with principal vein） and no callus part of leaves（with principal vein）already produced callus were the most suitable explants for rubber bagged seedlings leaves，callus induced by which showed tighten and yellow-green；the optimum callus induction medium was MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4% sucrose+3 g/L phytagel，leaves（with principal vein）and no callus part of leaves（with principal vein）have already produced callus were cultured in this medium，their callus inducing ratio can amount to 49.07% and 42.22%. Conclusion：after pretreatment，choose leaves（with principal vein） of annual bagged seedling leaves of Reyan 7-33-97 as explants that can be used to induce ideal callus.

Key words Reyan 7-33-97；Bagged seedlings；Leaves；Callus

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.014

為了拓寬巴西橡膠樹(shù)選育種途徑，從20 世紀(jì)50年代以來(lái)，橡膠育種學(xué)家們開(kāi)始著手研究其組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是20 世紀(jì)70 年代以后，中國(guó)、馬來(lái)西亞、法國(guó)、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡等國(guó)投入大量的人力、物力、財(cái)力對(duì)這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行廣泛的研究[1]。橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)的最初外植體主要是花藥和內(nèi)珠被，至今，王澤云等[2]利用巴西橡膠樹(shù)（Hevea Brasiliensis Müll. Arg.）“海墾2”、“熱研88一13”、“PB86”等無(wú)性系品種的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出高出愈率愈傷組織、胚狀體及完整植株。但花藥培養(yǎng)受開(kāi)花季節(jié)限制，而且花藥較小，剝離困難。Carron等[3]利用巴西橡膠樹(shù)“PB260”、“PB 235”和“PR107”等品種內(nèi)珠被誘導(dǎo)出緊實(shí)愈傷組織并建立再生體系，到目前為止已取得了較大進(jìn)展，其胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到60%～100%，由體細(xì)胞胚誘導(dǎo)出再生植株的頻率達(dá)到30%。周權(quán)男等[4]以橡膠樹(shù)6～10周幼果胚珠內(nèi)的內(nèi)珠被及珠心為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，建立了內(nèi)珠被再生體系，待花季過(guò)后還可以取內(nèi)珠被作外植體，延長(zhǎng)了獲取外植體的時(shí)間。于波等[5]以橡膠樹(shù)試管苗無(wú)菌幼根作外植體，經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑誘導(dǎo)了再生植株。橡膠樹(shù)其他外植體的組織培養(yǎng)，如利用未授粉胚珠及子房[6]均成功誘導(dǎo)出再生植株，但植株的誘導(dǎo)率和植株移栽成活率均較低。以橡膠樹(shù)葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究的報(bào)道不多，印度橡膠研究所通過(guò)葉片培養(yǎng)已得到再生植株，其次生體細(xì)胞胚發(fā)生和轉(zhuǎn)基因研究也已取得一定進(jìn)展[7-8]；孫愛(ài)花等[9]以橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97無(wú)菌苗為材料，采用不同激素及其濃度配比，誘導(dǎo)出無(wú)菌苗葉片愈傷組織。但以巴西橡膠樹(shù)袋裝苗葉片為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用海南橡膠大規(guī)模推廣品種熱研7-33-97袋裝苗葉片為實(shí)驗(yàn)材料，研究葉片不同預(yù)處理、0.1%升汞不同時(shí)間消毒、離體葉片切取部位、3種激素（6-BA、NAA、2，4-D）不同濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選出愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，為成功誘導(dǎo)該品種的體細(xì)胞胚、繼而培養(yǎng)成小植株奠定基礎(chǔ)，更為橡膠樹(shù)其他品種、類型及其他植物的組織培養(yǎng)研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為1年生巴西橡膠（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）優(yōu)良品種熱研7-33-97袋裝幼苗，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所陳雄庭研究員饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 （1）早上7：00～8：00采取淡綠期（變色期）大概長(zhǎng)10 ㎝的嫩葉，置冰上帶回實(shí)驗(yàn)室，先用約5%洗衣粉液浸泡10 min，再用流水沖洗葉片1 h；（2）將葉片置于無(wú)菌操作臺(tái)，以主脈為中心，縱切葉片，分成3部分，一部分為含主脈葉塊，另外2部分為不含主脈葉塊，切成大小約2 cm×4 cm的小葉塊； （3）用0.1%升汞分別消毒10、15、20、25 min，無(wú)菌水沖洗3次，在無(wú)菌操作臺(tái)上將其切成0.8 cm×0.6 cm的小葉塊；（4）接種到MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+7%蔗糖+2.2 g/L phytagel[9]的啟動(dòng)培養(yǎng)基上，而后將其置于（25±2）℃培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)。每種消毒時(shí)間分別接種27片小葉塊，3次重復(fù)，6周后觀察小葉塊在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、死亡率和存活率，以存活率最高的消毒時(shí)間為葉片的最佳消毒時(shí)間。

污染率=（污染的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)）×100%

死亡率=（死亡的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)）×100%

存活率=（存活的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)）×100%

1.2.2 預(yù)處理所需培養(yǎng)基配方篩選 （1）以MS為基本培養(yǎng)基，激素處理利用L9（34）正交表，將2， 4-D濃度設(shè)0、0.5、1.0 mg/L 3個(gè)梯度，6-BA設(shè)1.0、2.0、3.0 mg/L 3個(gè)梯度，NAA設(shè)0.2、0.5、1.0 mg/L 3個(gè)梯度，共同組合成9個(gè)處理（表1），分別加入3.0 g/L植物凝膠和4%蔗糖并調(diào)節(jié)pH至5.8，經(jīng)高溫高壓滅菌后備用； （2）采集淡綠期葉片后，將葉片按上述所確定的最佳消毒時(shí)間進(jìn)行消毒并按1.2.1同樣的葉片切取方式將葉片切成小葉塊，分別置于這9個(gè)處理的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理72塊（其中36塊含主脈葉塊、另外36塊不含主脈葉塊），3次重復(fù)，接種后置于（25±2）℃培養(yǎng)室進(jìn)行暗培養(yǎng)；（3）6周后，觀察接種葉塊形態(tài)（如皺卷、隆起、葉脈膨大及愈傷組織形成情況等），計(jì)算接種葉塊形態(tài)改變百分率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以葉塊形態(tài)改變百分率最高的液體培養(yǎng)基對(duì)袋裝苗葉片進(jìn)行預(yù)處理。

葉塊形態(tài)改變百分率=（葉塊形態(tài)改變的葉片數(shù)/總接種葉塊數(shù)）×100%

1.2.3 葉片的預(yù)處理 （1）配制上述葉塊形態(tài)改變百分率最高的液體培養(yǎng)基，不加蔗糖，調(diào)節(jié)pH至 5.8，并經(jīng)過(guò)高壓滅菌后備用： （2）在袋裝苗葉片古銅期，用滲透性較好的一層薄紙包裹住葉片，然后用滴管吸取上述液體培養(yǎng)基滴于薄紙上至完全浸潤(rùn)為止（圖1-A）。每天早上7：00和傍晚7：00各處理一次，待葉片長(zhǎng)至淡綠期，采樣放置冰上，取回備用。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 （1）將上述采回的葉片進(jìn)行浸泡、流水沖洗（方法同1.2.1），按1.2.1確定的最佳升汞消毒時(shí)間對(duì)葉塊進(jìn)行消毒，用無(wú)菌水沖洗3次： （2）接種方法同1.2.2，即在無(wú)菌操作臺(tái)上將其切成0.8 cm×0.6 cm小葉塊，分別接種到含不同濃度激素配比的培養(yǎng)基上（配方設(shè)計(jì)見(jiàn)表1），每個(gè)處理72塊（其中36塊含主脈葉塊、另外36塊不含主脈葉塊），3次重復(fù)。葉片接種后置于（25±2）℃培養(yǎng)室進(jìn)行暗培養(yǎng)； （3）6周后，統(tǒng)計(jì)出愈率，以出愈率最高的培養(yǎng)基為葉片愈傷組織誘導(dǎo)最優(yōu)培養(yǎng)基，同時(shí)分別統(tǒng)計(jì)不含主脈葉塊及含主脈葉塊的出愈率。

出愈率=（出現(xiàn)愈傷組織的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)）×100%

不含主脈葉塊出愈率=（不含主脈葉塊出現(xiàn)愈傷組織的葉塊數(shù)/接種不含主脈葉塊數(shù)）×100%

含主脈葉塊出愈率=（含主脈葉塊出現(xiàn)愈傷組織的葉塊數(shù)/接種含主脈葉塊數(shù)）×100%

1.2.5 含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分再誘導(dǎo) 將含主脈出愈葉塊置于無(wú)菌操作臺(tái)上，分別切出愈傷組織部分和非愈傷組織部分，將愈傷組織部分置于上述愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，取非愈傷組織部分葉塊（0.4 cm～0.6 cm）×（0.2 cm～0.4 cm）大小進(jìn)行再誘導(dǎo)培養(yǎng)。再誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用3種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，第一種培養(yǎng)基配方為上述出愈率最高的培養(yǎng)基x1=MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝膠；第二種培養(yǎng)基為x2=MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝膠；第三種培養(yǎng)基為x3=MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝膠。每種培養(yǎng)基接15個(gè)非愈傷組織部分葉塊進(jìn)行再誘導(dǎo)，3次重復(fù)。6周后，觀察并記錄再誘導(dǎo)愈傷組織塊及褐化愈傷組織塊情況，計(jì)算每種培養(yǎng)基再誘導(dǎo)愈傷組織出愈率和褐化率，以再誘導(dǎo)愈傷組織出愈率最高的培養(yǎng)基為出愈葉塊未出愈傷組織部分再誘導(dǎo)最優(yōu)培養(yǎng)基。

再誘導(dǎo)葉塊愈傷組織率=（再誘導(dǎo)出愈傷組織塊數(shù)/接種再誘導(dǎo)葉塊數(shù)）×100%

再誘導(dǎo)葉塊褐化率=（再誘導(dǎo)褐化的葉塊數(shù)/接種再誘導(dǎo)葉塊數(shù)）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理分析 實(shí)驗(yàn)處理均采用 SPSS18.0 進(jìn)行方差分析和多重比較（Duncan法）；用Microsoft Office Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間的消毒效果

升汞同一濃度不同消毒時(shí)間影響外植體消毒效果。在污染率、死亡率和存活率3個(gè)指標(biāo)上，0.1%升汞不同消毒時(shí)間的差異均達(dá)到顯著水平（p<0.05），其污染率為7.41%～79.01%，消毒10 min污染率最高，達(dá)79.01%，顯著高于其他處理；消毒25 min污染率最低，為7.41%，顯著低于其他處理。不同消毒時(shí)間的死亡率為20.99%～92.59%，其中消毒25 min死亡率最高，達(dá)92.59%，顯著高于其他處理；消毒10 min死亡率最低，為20.99%，顯著低于其他處理。升汞不同消毒時(shí)間其存活率為0～2.47%，消毒15 min存活率最高，達(dá)2.47%，其他3個(gè)處理存活率均為0%（表2）。綜合考慮污染率、死亡率及存活率，橡膠樹(shù)袋裝苗葉片最佳消毒方法為0.1%升汞消毒15 min。

2.2 葉片預(yù)處理所需培養(yǎng)基

在篩選升汞消毒時(shí)間時(shí)，接種葉塊在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)均未見(jiàn)形態(tài)的改變（如皺卷、隆起、葉脈膨大及形成愈傷組織等），重新設(shè)計(jì)培養(yǎng)基對(duì)葉塊進(jìn)行培養(yǎng)。

從試驗(yàn)結(jié)果可看出，9個(gè)處理之間差異均達(dá)到顯著水平（p<0.05）。接種6周后，除處理1外，其他處理均出現(xiàn)不同程度的葉塊形態(tài)改變（出現(xiàn)皺卷、隆起、葉脈膨大等現(xiàn)象），其葉塊形態(tài)改變百分率為4.17%～15.28%，其中葉塊形態(tài)改變率最高為處理8，達(dá)15.28%，顯著高于其他8個(gè)處理（表3）。以上9個(gè)處理均未出現(xiàn)愈傷組織。故按處理8配成液體培養(yǎng)基（即MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA）對(duì)袋裝苗葉片進(jìn)行預(yù)處理。

2.3 葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

經(jīng)過(guò)預(yù)處理的葉片，分別接種在按表1設(shè)計(jì)的9種培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2周后，葉塊陸續(xù)開(kāi)始皺卷、隆起，葉脈慢慢變白（圖1-B、C）；培養(yǎng)至第4周后，葉脈膨大處產(chǎn)生黃綠色、表面濕潤(rùn)的愈傷組織，一些葉塊的邊緣也有淡黃色的愈傷組織產(chǎn)生（圖1-E、F）；第6周后，愈傷組織面積慢慢擴(kuò)大，此時(shí)的愈傷組織質(zhì)地緊密，呈半透明狀（圖1-H）。

各處理的出愈率見(jiàn)表4。由表4可看出，經(jīng)預(yù)處理的葉片在9種培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其出愈率為5.56%～31.94%。其中出愈率最低的為處理1和處理7，均為5.56%，顯著低于處理4、處理5及處理8，與其他處理差異不顯著；出愈率最高的為處理8，達(dá)31.94%，顯著高于其他處理。

綜合分析表3和表4可知，在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，未經(jīng)預(yù)處理與經(jīng)過(guò)預(yù)處理的橡膠袋裝苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。未經(jīng)預(yù)處理的葉片經(jīng)培養(yǎng)后，僅出現(xiàn)皺卷、隆起、葉脈膨大等葉塊形態(tài)的改變，但均未出現(xiàn)愈傷組織；而經(jīng)預(yù)處理的葉片培養(yǎng)后均出現(xiàn)愈傷組織。說(shuō)明橡膠樹(shù)袋裝苗葉片經(jīng)預(yù)處理可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。

2.4 不含主脈葉塊及含主脈葉塊對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

一般而言，激素組合、濃度配比、外植體取材部位等不同，都會(huì)影響愈傷組織形成及生長(zhǎng)。本研究將經(jīng)預(yù)處理的含主脈葉塊和不含主脈葉塊分別接種在9種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，它們的出愈率不同（表5）。由表5可知，經(jīng)預(yù)處理的含主脈葉塊及不含主脈葉塊均出現(xiàn)愈傷組織。不含主脈葉塊出愈率為1.85%～14.81%，其中出愈率最低的為處理1和處理7，為1.85%，顯著低于處理8，與其他處理差異不顯著；出愈率最高的為處理8，達(dá)14.81%，顯著高于其他8個(gè)處理；含主脈葉塊出愈率為9.26%～49.07%，其中出愈率最低的是處理1和處理7，為9.26%，顯著低于處理4、5、8，與其他處理差異不顯著；出愈率最高的為處理8，達(dá)49.07%，顯著高于其他處理。比較含主脈葉塊和不含主脈葉塊在同一培養(yǎng)基上的出愈率可以看出，含主脈葉塊出愈率高于不含主脈葉塊出愈率。

在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，觀察含主脈葉塊與不含主脈葉塊形成愈傷組織的時(shí)間不同。含主脈葉塊培養(yǎng)4周后長(zhǎng)成直徑為5～6 mm的愈傷組織，其愈傷組織長(zhǎng)出部位有的分布在主脈尖端，有的覆蓋整個(gè)葉塊主脈，有的分布在葉邊緣，此時(shí)的愈傷組織質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)、呈黃綠色（圖1-E、F）。不含主脈葉塊要在培養(yǎng)5周后才長(zhǎng)出愈傷組織，且分布在葉片邊緣，此時(shí)的愈傷組織松軟，呈黃白色，平滑（圖1-D）。6周后，不含主脈葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織色澤淡黃、質(zhì)地松散、水漬化（圖1-G），不宜繼續(xù)培養(yǎng)，棄用；而含主脈葉塊誘導(dǎo)出的愈傷組織直徑為11～12 mm（圖1-H），邊緣出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，需轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。

2.5 含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分再誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分葉塊?。?.4 cm～0.6 cm）×（0.2 cm～0.4 cm）大小分別接入3種培養(yǎng)基中（x1、x2、x3）進(jìn)行再誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)。經(jīng)再誘導(dǎo)培養(yǎng)6周后，再誘導(dǎo)愈傷率及褐化率如圖2所示。由圖2可看出，3種培養(yǎng)基中，再誘導(dǎo)愈傷組織率最高為x1培養(yǎng)基，達(dá)42.22%，顯著高于其他2種培養(yǎng)基；其次為x2培養(yǎng)基，其再誘導(dǎo)愈傷組織率為11.11%；x3培養(yǎng)基上并未誘導(dǎo)出愈傷組織。從褐化率看，x1培養(yǎng)基褐化率最低，為53.33%，顯著低于其他2種培養(yǎng)基；其次為x2培養(yǎng)基，其再誘導(dǎo)褐化率為80%；在x3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的葉塊，褐化率最高，達(dá)91.11%。綜合考慮再誘導(dǎo)愈傷組織率及褐化率，出愈葉塊未出愈傷組織部分最佳再誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為x1培養(yǎng)基。

3 討論

葉片的預(yù)處理可以提高植物葉片組織培養(yǎng)的成功率。黃磊等[10]對(duì)蝴蝶蘭葉片研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷和高滲透壓預(yù)處理可以顯著提高外植體的類原球莖誘導(dǎo)效率；羅麗華等[11]研究了暗處理、萎蔫處理和預(yù)先質(zhì)壁分離3種不同預(yù)處理對(duì)人心果葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明3種處理均對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量增加有促進(jìn)作用。本研究采用液體培養(yǎng)基對(duì)橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97袋裝苗葉片進(jìn)行預(yù)處理，可有效誘導(dǎo)葉片愈傷組織的產(chǎn)生，在橡膠樹(shù)袋裝苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道中尚屬首次。初步推測(cè)是液體培養(yǎng)基使葉片從古銅期到淡綠期逐漸適應(yīng)離體培養(yǎng)環(huán)境，使得接種以后葉塊較快地啟動(dòng)脫分化，最終形成愈傷組織，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，消毒既是必要也是關(guān)鍵步驟。據(jù)報(bào)道，王麗萍等[12]發(fā)現(xiàn)采用75%酒精-15%次氯酸鈉5 min-0.1%升汞17 min的消毒劑組合對(duì)番木瓜消毒效果較好；汪騰越等[13]采用土沉香莖段為外植體，用洗衣粉水清洗外植體10 min，流水沖洗 30 min，而后在超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30 s，無(wú)菌水涮洗1次，0.1%升汞消毒5 min，無(wú)菌水涮洗3次，相比10%次氯酸鈉消毒5 min而言，此為最優(yōu)消毒方式。本研究采用0.1%升汞對(duì)橡膠樹(shù)袋裝苗淡綠期葉片消毒15 min，簡(jiǎn)化消毒過(guò)程，同樣達(dá)到較好的消毒效果。

有關(guān)植物葉片愈傷組織起始發(fā)生的部位已有一些報(bào)道。彭海峰等[14]對(duì)仙茅葉片（8 cm長(zhǎng)幼葉）組織培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)觀察表明，其愈傷組織起始于中脈維管束與上表皮之間的薄壁細(xì)胞，認(rèn)為對(duì)于仙茅葉片的組織培養(yǎng)，取材時(shí)應(yīng)選取長(zhǎng)度不超過(guò)8 cm的幼葉，并切取帶有中脈的葉塊，以提高仙茅的離體成苗率。暨淑儀等[15]在對(duì)茶葉片（芽下第1、2片葉）愈傷形成的組織細(xì)胞學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)，葉肉中的小葉脈周圍以及主脈中的薄壁細(xì)胞首先啟動(dòng)脫分化， 分裂形成分生細(xì)胞團(tuán)， 繼而形成愈傷組織。本研究對(duì)葉片進(jìn)行了分部位培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含主脈葉塊比不含主脈葉塊出愈率高。下一步工作將用更為具體的細(xì)胞學(xué)觀察來(lái)探討橡膠葉片愈傷組織的起源和形成過(guò)程。

盡管植物激素可調(diào)控多數(shù)物種器官的發(fā)生，但由于在不同組織中這些激素的內(nèi)在水平不同，因而對(duì)某一具體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程來(lái)說(shuō)，它們所要求的外源激素的水平也會(huì)有所不同[16]。不同植物葉片愈傷組織誘導(dǎo)率因所附加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度配比和組合的不同而不同。楊鳳玲等[17]對(duì)枇杷葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L 2，4-D，并認(rèn)為多數(shù)植物離體培養(yǎng)誘導(dǎo)脫分化都必須添加2，4-D，這是誘導(dǎo)愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最有效的激素之一。沈周高等[18]在對(duì)3個(gè)楊樹(shù)品種葉片進(jìn)行再生體系的建立過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織最佳誘導(dǎo)效果與NAA/6-BA 比值有一定的相關(guān)性。印度橡膠研究所Kala等[8]通過(guò)添加0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.2 mg/L 2，4-D 3種激素的組合誘導(dǎo)出葉片愈傷組織；孫愛(ài)花等[9]以熱研7-33-97無(wú)菌苗葉片為外植體材料，通過(guò)添加1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)其愈傷組織的產(chǎn)生，其誘導(dǎo)率達(dá)到26.7%。本研究以熱研7-33-97袋裝幼苗葉片為材料，通過(guò)添加3.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，成功誘導(dǎo)出愈傷組織，這在國(guó)內(nèi)尚屬首例。

本研究以橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97袋裝苗為材料，從古銅期開(kāi)始用液體培養(yǎng)基MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA對(duì)葉片進(jìn)行預(yù)處理直至淡綠期，用0.1%升汞對(duì)淡綠期葉片消毒15 min，分別切取含主脈葉塊和含主脈出愈葉塊未出愈傷組織部分至培養(yǎng)基（MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝膠）中培養(yǎng)，均可誘導(dǎo)出愈傷組織。

參考文獻(xiàn)

[1] Carron M P， Enjalric F， Lardet L， et al. Rubber（Rubber （Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. Biotechnol Agr Forest， 1989， 5： 228-245.

[2] 王澤云， 曾憲松， 陳傳琴， 等. 從離體花藥誘導(dǎo)巴西橡膠植株[J]. 熱作作物科技， 1978（4）： 1-7， 19.

[3] Carron M P， dAuzac J， Etienne H， et al. Biochemical and histological features of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis[J]. Indian J Natural Rubber Research， 1992， 5（1-2）： 7-17.

[4] 周權(quán)男， 李 哲， 孫愛(ài)花， 等. 一種建立橡膠樹(shù)內(nèi)珠被再生體系的方法[P]. 中國(guó)： 200810001452.6.

[5] 于 波， 周權(quán)男， 孫愛(ài)花， 等. 一種橡膠樹(shù)試管苗無(wú)菌根體細(xì)胞胚發(fā)生植株再生方法[P]. 中國(guó)： 200810226001.2.

[6] 肖三元， 陳正華. 三葉橡膠樹(shù)未授粉子房、胚珠培養(yǎng)再生植株研究初報(bào)[J]. 云南熱作科技， 1994， 17（3）： 18-20

[7] Kala R G， Anu K S， Manesh K， et al. Agrobacterium mediated genetic transformation in Hevea brasiliensis for recombinant protein production[J]. Journal of plantation crops， 2006， 34（3）： 582-586.

[8] Kala R G， Kuruvila L， Kumari Jayasree P， et al. Secondary embryogenesis and plant regeneration from leaf derived somatic embryos of Hevea brasiliensis[J]. Journal of plantation crops， 2008， 36（3）： 218-222.

[9] 孫愛(ài)花， 華玉偉， 黃天帶， 等. 不同激素配比對(duì)橡膠樹(shù)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（4）： 24-27

[10] 黃 磊， 陳之林， 吳坤林， 等. 創(chuàng)傷及高滲透壓預(yù)處理對(duì)蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)類原球莖的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（7）： 1 039-1 046.

[11] 羅麗華， 楊定海， 嚴(yán)虹羽. 不同預(yù)處理對(duì)人心果葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響[J]. 福建林業(yè)科技， 2009， 36（3）： 98-101.

[12] 王麗萍， 黃家河， 李柳娟， 等. 番木瓜（Carica papaya L.）外植體消毒方法[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2008， 4（3）： 181-183.

[13] 汪騰越， 周再知， 裘珍飛， 等. 土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 32（3）： 44-48.

[14] 彭海峰， 曹友培， 俞新華， 等. 仙茅葉片的組織培養(yǎng)及其細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 中草藥， 2007， 38（2）： 265-269.

[15] 暨淑儀， 嚴(yán)學(xué)成， 王毅軍. 茶葉片愈傷組織形成的細(xì)胞組織學(xué)觀察[J]. 茶葉， 1995， 21（2）： 11-13.

[16] 李浚明. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2005： 26-32.

[17] 楊鳳玲， 林順權(quán). 枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與保存[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2005， 34（4）： 1-5.

[18] 沈周高， 項(xiàng) 艷， 蔡 誠(chéng)， 等. 3個(gè)楊樹(shù)品種葉片再生體系的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006， 22（11）： 90-94.

責(zé)任編輯：林海妹