史后蕊等
摘 要 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索香蕉GAPDH基因家族的所有成員,并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位、進(jìn)化樹分析和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn),巴西蕉內(nèi)的GAPDH基因家族成員序列與小果野蕉基因組數(shù)據(jù)庫中提供的序列基本一致,同源性超過98%。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析表明,GAPDH基因家族成員在巴西蕉不同器官的表達(dá)模式多樣:MaGAPCP1,MaGAPC6/8/10/11成組成型表達(dá),其余的基因則在各組織器官間成差異型表達(dá),且差異型表達(dá)的基因在不同組織器官中表達(dá)模式也不相同,組成型表達(dá)的基因在不同組織器官中表達(dá)模式雖相同,但表達(dá)量有差異。GAPDH基因家族成員在表達(dá)模式上的多樣化,可能暗示其功能的多樣化,這種多樣化可能是在進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境而出現(xiàn)的功能分化或冗余。結(jié)果為進(jìn)一步研究GAPDH基因家族成員在香蕉生長(zhǎng)、發(fā)育,非生物脅迫,果實(shí)后熟等重要生物學(xué)過程中的功能奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 香蕉;GAPDH基因家族;生物信息學(xué)分析;表達(dá)分析
中圖分類號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
Bioinformatics and Expression Analysis of
Banana GAPDH Gene Family
SHI Hourui1,2, FENG Renjun2 *, WANG Jingyi2, CHAI Juan1,2, REN Mengyun1,2
LU Lifang2, ZHANG Yindong1 **
1 College of Agronomy, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,
Haikou, Hainan 571101, China
Abstract Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)is one of the key enzymes involved in glycolysis, gluconeogenesis and the Calvin cycle, which is widespread in higher plants playing an important role in plant growth and development. In this study, their subcellular location, phylogenetic tree and conserved domains prediction of the GAPDH gene family members from NCBI database and banana genome database were performed by the bioinformatics method. And all the members were amplified,cloned and sequenced from Musa AAA(Cavendish subgroup cv.Brazil), showing >98% sequence identity with Musa acuminata genome. The results showed that the expression patterns of GAPDH gene family members were diversity in different tissues of Musa AAA(Cavendish subgroup cv.Brazil). MaGAPCP1 and MaGAPC6/8/10/11 were constitutive expression genes, while the others were differentially expressed in different tissues. Although the expression patterns of constitutive expression genes were same, there were differences in expression levels. The diversity on the expression patterns of GAPDH gene family members may imply their functional diversity. Such diversification of biological function may be functions differentiation or redundant occurred in the evolution of GAPDH gene family. These results will lay the foundation for further research on the functions of GAPDH gene family in growth and development, abiotic stress, fruit ripening and other important biological processes of banana.
Key words Banana; GAPDH gene family; Bioinformatics analysis; Expression analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.013
甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehyrogenase,GAPDH)廣泛存在于高等植物中,是參與糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)的一個(gè)關(guān)鍵酶,按其生化特性可分為磷酸化和非磷酸化兩大類。根據(jù)磷酸化的GAPDH在細(xì)胞中的不同定位可將其分為GAPC、GAPCp(EC 1.2.1.12)和GAPA/B(EC 1.2.1.13)三類。GAPC定位于細(xì)胞質(zhì)中,其糖酵解和糖異生過程中氧化和磷酸化D-甘油醛3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate)轉(zhuǎn)變成1,3-二磷酸甘油酸(1,3-diphosphoglycerate),同時(shí)將NAD+還原成NADH。GAPCp和GAPA/B都是質(zhì)體型GAPDH,GAPCp主要存在于非綠色質(zhì)體中,依賴于NAD+,其通過與磷酸甘油酸激酶(PGK)催化兩個(gè)連續(xù)的反應(yīng),形成 3-磷酸甘油酸和 ATP[1-2]。GAPA/B由GapA和GapB亞基組成, 位于葉綠體中,依賴于NADPH,參與卡爾文碳循環(huán)光合固定CO2[3]。非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),簡(jiǎn)稱為NP-GAPDH(EC 1.2.1.9),依賴于NADP+,在細(xì)胞中催化氧化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸這一不可逆反應(yīng),同時(shí)產(chǎn)生NADPH。該酶是醛脫氫酶(ALDH)超家族中的一員,最新的研究將其歸為ALDH11家族[4],其與磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶在核酸與蛋白水平上沒有同源性。GAPDH在功能上與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),擬南芥GAPDH缺失突變體表現(xiàn)為植株矮小、根不能正常生長(zhǎng)和花粉敗育[5-6]??鼓嫘匝芯拷Y(jié)果表明:過量表達(dá)GAPDH基因的水稻耐鹽性提高等[7];小麥GAPDH蛋白受聚乙二醇、鹽和ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),受低溫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)[8]。擬南芥幼苗在鎘元素脅迫下,根中胞質(zhì)磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPC1和GAPC2產(chǎn)生應(yīng)答,GAPC1在轉(zhuǎn)錄水平上比GAPC2更敏感[9]。
香蕉(Musa spp.)是世界上重要的水果之一,同時(shí)也是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物。除三倍體AAA、AAB、ABB外,還有二倍體AA、BB、AB,四倍體AAAA,AABB、AAAB,這使香蕉具有特殊的生物學(xué)特性和遺傳特性。二倍體小果野蕉(Musa acuminate)全基因組測(cè)序完成[10],這為香蕉分子生物學(xué)研究的發(fā)展提供了良好的平臺(tái)。香蕉GAPDH受乙烯誘導(dǎo)、干旱脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá),并在維持NAD/NADH穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究在香蕉全基因組水平上對(duì)GAPDH基因家族進(jìn)行分子進(jìn)化和保守結(jié)構(gòu)域分析,并取栽培品種巴西蕉為試驗(yàn)材料,對(duì)香蕉GAPDH基因家族成員進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,以期為進(jìn)一步研究該家族在巴西蕉生長(zhǎng)及形態(tài)發(fā)育,非生物脅迫,果實(shí)后熟等重要生物學(xué)過程中的功能奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)材料為生長(zhǎng)良好的巴西蕉植株,取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地。采集巴西蕉的根、葉、花、果,清洗后用液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
香蕉GAPDH基因家族的序列信息從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(http://banana-genome.cirad.fr/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行查找。擬南芥GAPDH基因及序列信息來自擬南芥數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)和NCBI數(shù)據(jù)庫。
1.2 方法
1.2.1 香蕉GAPDH基因家族生物信息學(xué)分析
通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫和香蕉基因組數(shù)據(jù)庫,搜索并獲取香蕉GAPDH基因序列信息。根據(jù)獲取的基因組信息,采用在線軟件INRA和PSPORT對(duì)香蕉GAPDH基因家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html和http://psort.hgc.jp/)。將檢索到香蕉GAPDH氨基酸序列與已知的GAPDH氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,再對(duì)香蕉GAPDH進(jìn)行分類。利用軟件MEGA 5.2對(duì)香蕉GAPDH蛋白的氨基酸序列與擬南芥和其它物種的GAPDH進(jìn)行多重序列對(duì)比,具體方法為:刪除兩端未對(duì)齊的氨基酸序列,根據(jù)Neighbor-Joining法,并進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),構(gòu)建GAPDH基因家族進(jìn)化樹。利用DNAMAN軟件對(duì)香蕉GAPDH的蛋白多重序列進(jìn)行比對(duì),利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)香蕉GAPDH蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。
1.2.2 香蕉總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取-80 ℃保存的香蕉根、葉、花、七成熟果等組織,分別在液氮中充分研磨,采用改良CTAB法提取總RNA,利用凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和完整性。DNaseⅠ酶除去總RNA中的基因組DNA,按照Fermentas公司RerertAidTM Premium Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈,操作均按說明書進(jìn)行。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中香蕉Actin基因序列,設(shè)計(jì)檢測(cè)引物,見表1。通過PCR擴(kuò)增香蕉的Actin基因,檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄是否成功。
1.2.3 香蕉GAPDH基因家族的表達(dá)分析 對(duì)香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中獲取的GAPDH基因家族成員序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1),以巴西蕉RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板,克隆到目的片段,送生物公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與基因組預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)。以香蕉Actin為內(nèi)參基因,以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板,采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)GAPDH基因家族在巴西蕉不同組織器官中的表達(dá)情況,并根據(jù)內(nèi)參β-actin亮度,調(diào)整cDNA模板的量,最終確定半定量RT-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系。
2 結(jié)果與分析
2.1 香蕉GAPDH基因家族的成員分布
通過在NCBI和香蕉基因組數(shù)據(jù)庫上對(duì)GAPDH基因的檢索、篩選,共獲得18個(gè)香蕉GAPDH基因家族成員,分布在香蕉第2、5、6、7、8、9、10、11號(hào)染色體和Un-random染色體上。其中有2個(gè)為編碼非磷酸化GAPDH的基因,將其命名為MaNP-GAPDH1和MaNP-GAPDH2;其余16個(gè)為編碼磷酸化GAPDH的基因。磷酸化的GAPDH分為GAPA/B,GAPCp和GAPC三類,通過與其他物種GAPDH氨基酸序列比對(duì)分析和在線亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),其中4個(gè)定位于葉綠體的磷酸化GAPDH的編碼基因,分別命名為MaGAPA1、MaGAPA2、MaGAPB1和MaGAPB2;1個(gè)定位于非綠色質(zhì)體的磷酸化GAPDH的編碼基因,命名為MaGAPCp1;11個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)的磷酸化GAPDH的編碼基因,依次命名為MaGAPC1至MaGAPC11,詳見表2。
2.2 香蕉GAPDH的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
擬南芥GAPDH和磷酸化的MaGAPDH蛋白氨基酸序列重建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(圖1-A):磷酸化的香蕉GAPGH蛋白家族清晰地分為GAPC,GAPCp和GAPA/B三個(gè)主支,且功能相似的蛋白聚為一束,MaGAPC5、MaGAPC7-11和AtGAPC1、AtGAPC2處于相同分支,MaGAPCp1和AtGAPCp1、AtGAPCp2處于相同分支,MaGAPA1、MaGAPA2和AtGAPA1、AtGAPA2處于相同分支,MaGAPB1、MaGAPB2和AtGAPB處于相同分支。由圖1-A還發(fā)現(xiàn),MaGAPC3/6和GAPCp類蛋白聚合在一起,說明在MaGAPC3/6的定位預(yù)測(cè)上可能不準(zhǔn)確,其也可能定位在質(zhì)體中,這有待進(jìn)一步研究證明。
將非磷酸化的MaNP-GAPDH氨基酸序列和檢索到的擬南芥、苜蓿、水稻、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥中的NP-GAPDH氨基酸序列重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1-B),發(fā)現(xiàn)MaNP-GAPDH和單子葉植物水稻、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥的NP-GAPDH處于同一分支,和苜蓿、擬南芥的NP-GAPDH分開聚類,根據(jù)進(jìn)化遠(yuǎn)近的關(guān)系推斷NP-GAPDH可能已經(jīng)在單、雙子葉植物分化形成時(shí)進(jìn)行了分化。
2.3 香蕉GAPDH的蛋白結(jié)構(gòu)域分析
磷酸化MaGAPDH蛋白的多重序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖2),香蕉中的GAPDH保守性主要表現(xiàn)在基因的下游,在上游的保守性較低。采用CDD對(duì)MaGAPDH基因家族可能含有的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)磷酸化的MaGAPDH蛋白都存在著高度保守的Gp_dh_N和Gp_dh_C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,圖中細(xì)線框中的區(qū)域?yàn)镚p_dh_N結(jié)構(gòu)域,粗線框中的區(qū)域?yàn)镚p_dh_C結(jié)構(gòu)域。非磷酸化的MaGAPDH蛋白都含有ALDH-F11結(jié)構(gòu)域。香蕉GAPDH基因家族具體蛋白結(jié)構(gòu)域詳見表3。
2.4 總RNA和反轉(zhuǎn)錄的質(zhì)量分析
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所提取的香蕉根、葉、花、果總RNA的28S、18S條帶清晰、完整,說明RNA沒有出現(xiàn)降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280的比值介于1.8~2.0,表明總RNA的純度較高,沒有糖、蛋白質(zhì)等污染,可以用與反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。用Actin對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖3),表明合成的cDNA第一條鏈質(zhì)量良好,可以作為半定量RT-PCR的模板。
2.5 香蕉GAPDH基因家族組織器官特異性表達(dá)
通過目的片段測(cè)序發(fā)現(xiàn),巴西蕉的GAPDH基因家族成員序列與香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中提供的序列基本一致,同源性超過98%,其GAPDH基因家族成員與香蕉基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的GAPDH基因家族成員相對(duì)應(yīng)。香蕉GAPDH基因家族不同器官特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示:MaGAPA1/2、MaGAPB1/2、MaGAPC3、MaNPGAPDH2在不同組織器官有明顯的表達(dá)特異性,其中MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2、MaNP-GAPDH2主要在葉和果中表達(dá),并在葉中表達(dá)量最高,在根和花中不表達(dá)或表達(dá)量很低;MaGAPC3主要在果中高表達(dá),在根和葉中低表達(dá);MaGAPC5/9在葉、花、果中表達(dá)量較高,在根中表達(dá)量較低;MaGAPC7主要在花、果中表達(dá),在根和葉中表達(dá)量很低;MaGAPC1在根和葉中表達(dá)量最高。MaGAPCp1、MaNP-GAPDH1、MaGAPC2/6/8/10/11在各組織器官中也是均有表達(dá),并且表達(dá)水平基本一致。MaGAPC4在根、葉、花、果中均未檢測(cè)到表達(dá)。
3 討論
國(guó)外對(duì)植物GAPDH研究主要集中于GAPDH蛋白或基因在模式植物中的功能,涉及植物激素信號(hào)、糖代謝、蛋白互作、抗氧化和抗逆性等諸多方面。在擬南芥中,GAPDH與ABA信號(hào)途徑存在關(guān)聯(lián),GAPDH的功能缺失會(huì)引起擬南芥突變體植株在生長(zhǎng)發(fā)育、氣孔關(guān)閉和種子萌芽等方面對(duì)外源ABA不敏感,然而突變體中內(nèi)源ABA含量正常[11]。非磷酸化的GAPDH廣泛參與多種信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的SnRK(蔗糖酵解型蛋白激酶)磷酸化,并失去其活性[12]。GAPDH還可通過與磷酸核酮糖激酶、葉綠體小蛋白CP12形成多蛋白復(fù)合體的形式調(diào)節(jié)光合作用的碳同化過程[13]。研究還發(fā)現(xiàn),GAPDH能通過提高抗氧化相關(guān)酶的表達(dá)抑制活性氧的過多積累,從而提高植物的抗逆性[7,14]。此外,GAPDH還廣泛參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,它作用于核tRNA運(yùn)輸、DNA復(fù)制與修復(fù)等過程,也參與調(diào)控組蛋白基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)端粒結(jié)構(gòu)、核膜融合和微管蛋白的活性等生物學(xué)過程[15-17]。
國(guó)內(nèi)研究者分別從小麥、三七、西伯利亞蓼等十幾種植物中克隆了GAPDH基因,并對(duì)各自的基因序列做了相關(guān)分析[18-21]。結(jié)果表明,生理型雄性不育小麥發(fā)育過程中,不同發(fā)育期GAPDH表達(dá)量存在顯著差異﹐西伯利亞蓼經(jīng)NaHCO3脅迫處理后,葉部PsGAPDH表達(dá)量減少,莖部隨脅迫時(shí)間增加表達(dá)量增加;PsGAPDH還能提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性。
但是,目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)GAPDH蛋白或基因在香蕉中的研究很少。Vanhove等[22]利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選香蕉抗旱品種時(shí),發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下GAPDH上調(diào)表達(dá),并猜想其在維持NAD/ NADH穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用;本實(shí)驗(yàn)室通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),香蕉果皮中GAPDH受乙烯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[23]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,在香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中搜索香蕉的GAPDH家族成員,共搜索到18個(gè)香蕉GAPDH蛋白。對(duì)檢索到的18個(gè)香蕉GAPDH蛋白及其基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),MaGAPA1-2、MaGAPB1-2亞細(xì)胞定位于葉綠體中,說明MaGAPA1-2、MaGAPB1-2可能參與香蕉光合作用;MaGAPCp1,MaGAPC1-11亞細(xì)胞定位于質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),GAPDH基因家族成員在香蕉不同器官的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式多樣(圖3),部分基因在各組織器官間成差異型表達(dá),另一部分則成組成型表達(dá)。差異型表達(dá)的基因在不同組織器官間的表達(dá)模式都不相同,如MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2主要在香蕉的葉和果表達(dá),在根和花非綠色部位基本不表達(dá),這與閆洪波等對(duì)鴨梨GAPDH基因的研究結(jié)果一致[24]。MaGAPC類基因(MaGAPC1/3/5/7/9)在香蕉的根、葉、花、果都有表達(dá),但表達(dá)量卻有明顯差異,這些MaGAPDH基因可能參與香蕉抗逆境脅迫、果實(shí)的淀粉積累和成熟等生物學(xué)過程。組成型表達(dá)的基因表達(dá)量雖在組織器官間沒有差異,但各個(gè)基因間的表達(dá)量卻不同,如MaGAPC8/10,這類GAPDH一般作為代謝的基礎(chǔ)酶類,在維持植物物質(zhì)與能量代謝穩(wěn)定方面有重要的調(diào)控作用,在各器官和植物不同發(fā)育時(shí)期都平穩(wěn)表達(dá)[25],這類GAPDH基因可作為候選內(nèi)參基因。GAPDH基因家族成員在表達(dá)模式上的多樣化,意味著其在組織、器官甚至亞細(xì)胞水平上進(jìn)行了功能的特性化或?qū);?,進(jìn)而在功能上也表現(xiàn)出多樣性。因此筆者推斷,GAPDH基因家族的多成員現(xiàn)象可能與其在進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境而出現(xiàn)的功能分化或冗余有關(guān)。
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