陳晶晶等

摘 要 應用RACE方法克隆得到番荔枝CO同源基因cDNA的全長，命名為AsCO（基因登錄號：KJ699387）。AsCO基因開放閱讀框1 083 bp，編碼360個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子量為39.65 ku，等電點為4.72。序列分析結(jié)果顯示：AsCO基因編碼的蛋白氨基端具有2個典型的B-box 型鋅指結(jié)構(gòu)域，碳端具有CCT結(jié)構(gòu)域，屬于第一類CO基因。同源性分析結(jié)果表明，AsCO蛋白與北美木蘭CO蛋白親緣關(guān)系最近，與其它植物的親緣關(guān)系較遠。定量 RT-PCR分析結(jié)果表明，AsCO基因在去除葉柄的花芽中表達量比不去葉柄的表達量高，在花蕾發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。

關(guān)鍵詞 番荔枝；CO基因；序列分析；表達模式

中圖分類號 Q949.747.3 文獻標識碼 A

Abstract A full-length cDNA sequence of homologous CO gene was cloned by employing RACE from cherimoya， which was named as AsCO（GenBank accession No. KJ699387）. The AsCO gene open reading frame（ORF）is 1 083 bp in length，encoding a protein of 360 amino acids，with an estimated molecular weight and an isoelectric point of 39.65 ku and 4.72 respectively. The bioinformatics characterization indicated that the protein encoded by AsCO gene has two typical B-box type zinc finger domain structure in amino terminal， and CCT domain structure in carbon terminal，which belongs to the first kind of CO gene. A comparison of the homologous amino acid sequences from different species indicated that AsCO protein has the closest relative with Magnolia virginiana CO protein， relationships with other plant is far. Expression analysis by qRT-PCR indicted that in the flower bud of removing petioles， the AsCO gene expression was higher than that of which keeping petioles，and in the different stages of flower buds development，gene expression presents firstly increasing and then reducing.

Key words Cherimoya；CO gene；Sequence analysis；Expression pattern

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.013

African Pride（以下簡稱AP）番荔枝（Annona squamosal L.）是從阿蒂莫耶番荔枝雜交種（Annona atemoya Hort.）中選出的一個優(yōu)良熱帶果樹，是目前世界熱帶及亞熱帶地區(qū)最受歡迎的番荔枝之一。番荔枝的芽為復芽，腋芽被葉柄抱嵌，若葉柄不脫落，腋芽一般不會萌發(fā)。在生長季節(jié)，主要靠人工將老熟枝條上任一節(jié)位的葉片和葉柄摘除，并結(jié)合剪頂使腋芽抽發(fā)新梢，有80%以上的新梢能夠成花[1]。這種催花方式需要對每個成熟枝條進行處理，才能誘導枝條成花，這種方式費工費時，且如果對該技術(shù)掌握不到位，會影響番荔枝的產(chǎn)期調(diào)節(jié)和果實質(zhì)量。對于番荔枝這種獨特的成花機制，國內(nèi)外少有深入的研究，目前關(guān)于開花相關(guān)基因在此過程中發(fā)揮的作用還不清楚。

CO（CONSTANS）是調(diào)控植物開花早晚和光周期調(diào)控途徑中的一個重要基因[2-3]，位于生物鐘的輸出途徑，是生物鐘和開花時間基因之間監(jiān)測日照長度的重要元件，可進行光信號和生物鐘信號的整合，并激活下游基因FT的表達從而誘導植物開花[4]，但在番荔枝成花過程CO基因在各器官的表達情況及作用機理的研究尚未見報道。CO基因首先在擬南芥中分離得到[5]，利用擬南芥的CO基因序列通過圖位克隆和同源克隆的方法，目前已經(jīng)在水稻[6]、牽?；╗7]、蘿卜[8]、美洲黑楊[9]、小麥[10]、大麥[11]、多年生黑麥草[12]、馬鈴薯[13]、番茄[14]、豌豆[15]、葡萄[16]、高羊茅[3]、國蘭[17]、煙草[18]、北美木蘭等多個不同科（屬）的物種中克隆得到CO同源基因。目前研究結(jié)果表明，擬南芥中CO基因家族共有17 個成員[19]，水稻中共有16個成員[11]，該家族基因可編碼包含兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，一個是靠近氨基端的鋅指結(jié)構(gòu)域，另一個是靠近碳端的CCT（CO、 CO-like、 TOC1）結(jié)構(gòu)域[3]。根據(jù)靠近氨基端的鋅指B-box結(jié)構(gòu)的不同，可把CO基因家族分為3類：第1類基因有2個鋅指 B-box；第2類基因只有1個鋅指 B-box；第3類基因含有1個B-box和1個結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域[19]。研究結(jié)果表明，B-box類型鋅指結(jié)構(gòu)的GATA轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)蛋白之間相互作用的功能[20]，CCT結(jié)構(gòu)域則參與核定位和蛋白之間的相互作用[21]。基因在鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生突變后基因功能便會喪失，而基因在CCT結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后只會使開花延遲[19]。

本研究以AP番荔枝為實驗材料，基于NCBI上blast得到的CONSTANS基因序列設計的簡并引物，利用3′RACE與5′RACE方法從AP番荔枝中分離出CONSTANS基因，并對其在番荔枝花芽和花蕾中的表達特性進行初步研究，為番荔枝開花途徑分子機理的闡明和花期調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 AP番荔枝供試樣品采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所種植資源圃，每年3月進行修剪，選取3種處理方式下長出的花芽（正常：枝條不去頂，不去葉柄；處理1：枝條去頂，去除葉柄；處理2：枝條不去頂，去除葉柄）及處理1（生產(chǎn)上的方式）修剪后新長出不同發(fā)育階段的花蕾作為實驗材料。

1.1.2 試劑 RACE試劑盒（SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit，Clontech），pMD18-T克隆載體、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser），LA Taq、dNTPs、DL 2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；Dynamo Color Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Fisher）購自廣州賽哲生物公司；RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸桿菌、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化（北京）有限公司。酵母提取物、蛋白胨、瓊脂糖、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素等購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒中的方法，提取AP番荔枝花芽和不同發(fā)育時期花蕾中的總RNA。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit（用于基因克?。┖?PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（用于定量PCR）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照其說明書進行逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

1.2.2 番荔枝CO同源基因全長的克隆 利用DNAMAN生物軟件對已知植物CO同源基因進行同源比對分析，在其保守區(qū)設計簡并上下游引物 CO-f和CO-r（表1）。PCR擴增番荔枝CO同源基因的模板為AP番荔枝花芽cDNA，總體系為25 μL（cDNA 1 μL；上下引物各1 μL；dNTPs 0.5 μL；ddH2O 18.80 μL；buffer 2.5 μL；LA Taq 0.2 μL）。擴增條件為：95 ℃預變性 4 min；95 ℃變性 40 s，53 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。最后PCR擴增產(chǎn)物回收，連接到T載體，送到測序公司進行測序。

根據(jù)得到的番荔枝CO同源基因序列，按照RACE試劑盒的要求，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 第一鏈。分別設計5′RACE巢式引物CO-GSP1、CO-NGSP1 和3′RACE巢式引物CO-GSP2、CO-NGSP2（表1）。 第一輪反應程序為：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環(huán)。8 μL PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，如無法檢測到明顯條帶，即用第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進行二次巢式擴增，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。所有PCR擴增到條帶后，均回收目的條帶，并對目的條帶進行凝膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序。

1.2.3 番荔枝CO基因序列分析 在NCBI中利用Blast檢索番荔枝CO同源基因的相似性；利用DNAStar軟件尋找開放閱讀框，預測相對分子量和等電點，利用DNAMAN軟件進行序列拼接、氨基酸序列同源性分析、構(gòu)建CO蛋白系統(tǒng)進化樹；并通過ExPASy（http：//www. expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進行蛋白質(zhì)的疏水性分析；運用Target（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行亞細胞定位預測；應用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/ npsa_sopma.html）預測其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用NCBI的CDD（conserved protein domain database）進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.2.4 番荔枝CO同源基因在花芽和花蕾中的表達分析 采用SYBR Green Ⅰ染料法，利用定量RT-PCR 探討番荔枝CO基因在花芽和花蕾的不同發(fā)育時期的表達情況。根據(jù)獲得的番荔枝CO基因的全長序列，在其不保守區(qū)域設計定量引物qCO-F與qCO-R，擴增片段大小為158 bp（表1）。根據(jù)前期工作克隆得到的番荔枝管家基因AsActin設計1對內(nèi)參定量引物qActin-F和qActin-R，擴增片段大小為189 bp（表1）。定量RT-PCR反應體系為：2×DyNAmo color Flash SYBR Green master mix 10 μL、模板cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.6 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s（real time 熒光采集），40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃（熒光采集結(jié)束），40 ℃ 30 s（冷卻）。每個樣品在同一板中重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 番荔枝CO同源基因全長的克隆

提取的番荔枝各組織RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示28S、18S條帶明亮清楚，基本無DNA條帶（圖1-A）。紫外分光顯示：A260/280值為1.93左右，A260/230值為2.25左右。這表明提取的番荔枝RNA基本無降解及污染，可滿足后續(xù)工作的需要。

以番荔枝花芽提取的總RNA為模板，利用簡并引物CO-f和CO-r進行RT-PCR擴增，獲得1條700 bp 左右大小條帶（圖1-B），測序后在NCBI上Blast檢索發(fā)現(xiàn)，該序列與CO基因具有很高的同源性，確定該擴增片段為番荔枝CO基因的編碼序列。利用5′RACE引物CO-GSP1、CO-NGSP1 和3′RACE引物CO-GSP2、CO-NGSP2，與RACE 試劑盒中的引物相結(jié)合進行套式PCR，克隆其5′端與3′端。經(jīng)過5′RACE和3′RACE分別獲得了大小為508、916 bp的PCR產(chǎn)物（圖1-C、D），克隆測序后發(fā)現(xiàn)，5′端和3′端序列與已知序列有重疊，為番荔枝CO基因mRNA的5′端和3′端序列。3個序列經(jīng)DNAMAN軟件拼接后得到番荔枝CO基因完整cDNA序列，去除polyA后，全長1 557 bp，然后利用全長引物qcCO-f和qcCO-r，擴增到長約1 355 bp的片段（圖1-E），測序結(jié)果與拼接序列一致，命名為AsCO，提交GenBank，獲得登錄號為KJ699387。

2.2 番荔枝CO基因編碼蛋白分析

經(jīng)DNAStar生物軟件分析AsCO基因cDNA的全序列，其中發(fā)現(xiàn)1個完整的開放閱讀框，起始密碼子在26位，終止密碼子在1 109位，其開放閱讀框為1 083 bp，推測編碼360個氨基酸，預測蛋白質(zhì)的等電點為4.72，相對分子質(zhì)量為 39.65 ku。

疏水性分析：一方面可為二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果提供參考，另一方面可為結(jié)構(gòu)域及功能域的劃分提供依據(jù)。利用ExPASy的ProtScale軟件對AsCO蛋白進行水性分析，結(jié)果顯示AsCO蛋白C端偏向疏水性，N端疏水性明顯，位于分子內(nèi)部；中間部分親水性與疏水性交替出現(xiàn)，但總體來說該蛋白親水性更強。疏水性最大值為 1.567，最小值為-3.589，達-2以下的親水峰有8處（圖2）。

應用SOPMA預測AsCO蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AsCO蛋白含有約25.83%的α-螺旋、11.11%的延伸鏈、2.5%的β-轉(zhuǎn)角和60.56%的不規(guī)則卷曲（圖3）。

運用軟件TargetP和SignalP預測AsCO蛋白的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)AsCO蛋白在線粒體、葉綠體上沒有信號肽，因此AsCO可能存在于細胞質(zhì)中。

2.3 AsCO蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

應用NCBI中的CDD程序?qū)ζ湫邪被岜Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) AsCO蛋白N端含有2個B-box 型鋅指結(jié)構(gòu)域，分別在13～57和56～100的位置，C端含有45個氨基酸的CCT結(jié)構(gòu)域，在56～337位置。B-box鋅指構(gòu)型為CX2 CX8 CX7 CX2 CX4 HX 8H（X為任意氨基酸），與擬南芥CO蛋白構(gòu)型相似[5]，屬于CO基因家族的第一類。B-box和CCT結(jié)構(gòu)域中含有CO功能必不可少的氨基酸殘基，同時CCT結(jié)構(gòu)域中還含有核定位信號。與其他25種植物中已經(jīng)克隆的同源基因編碼蛋白的氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明：在N端的鋅指結(jié)構(gòu)中，第1個B-box完全保守，第2個B-box的保守性較低（圖4），如禾本科植物中的大麥、高羊茅、黑麥草中的第一、第三和第五個半胱氨酸被其他氨基酸代替，而在CO基因編碼蛋白的C端有保守的核定位區(qū)域（圖5），該區(qū)域在進化過程中非常保守。綜上所述，鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域的保守性低于核定位信號區(qū)域。

2.4 番荔枝CO基因在花芽和花蕾中表達模式分析

通過分析CO基因在3種不同處理方式下分化的花芽中的表達量（圖6），處理1花芽和處理2花芽中CO的表達量均明顯高于正?；ㄑ恐械谋磉_量，分別是正?；ㄑ勘磉_量的1.67、1.72倍。而CO基因在花蕾發(fā)育的不同階段，總體上呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在花蕾發(fā)育階段中的花蕾3表達量最高，當花蕾快要開裂時，表達量降到最低，說明CO基因?qū)﹂_花過程的調(diào)控呈現(xiàn)動態(tài)變化。處理1和處理2花芽中CO的表達量均比花蕾中各發(fā)育時期的高，推測在花芽分化期更需要CO基因的表達。

3 討論與結(jié)論

本研究以NCBI 上公布的CO同源基因為基礎，設計了1對在CO基因保守區(qū)擴增的簡并引物，再根據(jù)得到的番荔枝CO基因片段，利用5′RACE和3′RACE手段獲得了番荔枝CO基因的全長序列，在NCBI上進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)番荔枝CO基因具有CO基因典型的2個B-box 類型鋅指結(jié)構(gòu)和CCT結(jié)構(gòu)域，屬于CO基因分類的第一類，命名此基因為AsCO，并在GenBank申請登錄號為KJ699387。

本研究從番荔枝中克隆到光周期途徑的關(guān)鍵基因CO，目前對番荔枝開花相關(guān)基因的研究較少，在NCBI上也僅發(fā)現(xiàn)同屬木蘭目的北美木蘭CO基因被克隆，同源比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其同源性有75%，而與其他不同科、屬植物的CO基因的同源性都較低。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以看出，CO基因不僅在裸子植物和被子植物間存在分化，而且在單子葉植物和雙子葉植物及不同的科、屬植物中也存在分化。由此可見，在植物的進化過程中，CO基因在不斷地發(fā)生變化與分歧。

成花轉(zhuǎn)變過程由植物自身遺傳因子和外界環(huán)境因素兩方面共同決定，并受錯綜復雜的網(wǎng)絡信號傳導途徑調(diào)控[22]。番荔枝側(cè)芽被葉柄基部緊緊包裹，葉片不脫落，新芽就不能萌發(fā)，但通過短截去葉等技術(shù)措施，卻能在去葉的節(jié)位萌發(fā)新梢并開花結(jié)果，在番荔枝成花轉(zhuǎn)變過程中，開花調(diào)控基因CO的作用如何，對其在花芽和花蕾中的表達進行了初步研究。通過比較不同處理手段對CO基因表達量的影響發(fā)現(xiàn)，去掉葉柄后，處理1花芽和處理2花芽的表達量均比不去葉柄的處理高，說明只有去掉葉柄，側(cè)芽暴露出來，開花基因CO才開始大量表達，其原因可能是側(cè)芽暴露出來，才能感受到光照信號，促進開花相關(guān)基因的表達。CO基因能引起花分生組織基因的表達，作用機理是將來自于光周期途徑中的信號傳遞到FLOWERING LOCUS T（FT）和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSIONOF CO1（SOC1）等成花信號樞紐處來促進開花[23]。而處理1和處理2的區(qū)別在于形成花芽數(shù)量的多少，處理1是番荔枝生產(chǎn)上的處理方式，去掉枝條頂端能促進更多的側(cè)芽形成花芽。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)在花蕾發(fā)育的不同階段，CO基因的表達也呈現(xiàn)不同的變化趨勢，當處于花蕾發(fā)育中期時（花蕾3），表達量達到最大，當花蕾快要開裂時（花蕾5）表達量最低，說明CO在花蕾發(fā)育的不同階段通過不斷調(diào)整其表達量來發(fā)揮其調(diào)控作用的。在不同的植物當中，CO基因的作用并不完全一樣，如番茄中的SlCO2基因與調(diào)控開花時間無關(guān)，但其在擬南芥中過量表達可使擬南芥花期延遲，而牽?；ǖ腜nCO基因則可以彌補擬南芥co突變體的晚花表型并使其比野生型擬南芥開花期提前[24]，在番荔枝中僅初步分析了其在不同處理下花芽和花蕾不同發(fā)育階段的表達情況，對于其在番荔枝成花調(diào)控中的具體機制還需要進一步研究。CO在植物進化中相對保守，各個物種中的CO基因都包含有1個保守的鋅指結(jié)構(gòu)域和1個CCT結(jié)構(gòu)域，但不同植物的CO同源基因的拷貝數(shù)有所不同，各個拷貝發(fā)揮的功能也不一致，因此有必要對每一物種的各個CO同源基因進行表達和功能驗證。現(xiàn)有的研究在CO同源基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和功能方面已取得了一定的進展，這為利用基因工程進行植物的花期改良工作奠定了良好的基礎，而在番荔枝上闡明其獨特的成花機理，以及如何利用控制CO基因表達、促進葉片脫落、使得新芽萌發(fā)、實現(xiàn)不通過短截去葉等技術(shù)措施就能萌發(fā)新梢并開花結(jié)果，為番荔枝的生產(chǎn)應用提供了新的思路，這也是今后的研究方向。

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