郭雁君等

摘要[目的]建立枳殼離體培養(yǎng)再生體系。[方法]采用均勻設(shè)計研究了不同時期枳殼莖尖、 莖段、芽的愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化、及生根情況。[結(jié)果]愈傷組織誘導(dǎo)率及生長量由高到低為春梢> 夏梢>秋梢>冬梢；不同時期外植體誘導(dǎo)愈傷組織所需生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類、濃度、配比不同，佳。[結(jié)論] 為枳殼快速繁殖、脫毒技術(shù)和相關(guān)細(xì)胞工程的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞枳殼；離體培養(yǎng)；均勻設(shè)計

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）21-06934-03

Study on the Establishment of Regeneration System of Poncirus trifoliate（L.） Raf by Uniform Design

GUO Yanjun， JI Qianhua et al（Department of Biology， Fruit Tree Research Institute， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061）

Abstract[Objective] The aim was to study the establishment of regeneration system of Poncirus trifoliate（L.） Raf.[ Method]A regeneration method via callus was established in which uniform design was employed in the experimentation. Induction rate and quantity of callus were influenced by the types of explants. [Result]Callus were induced satisfactorily with spring shoots cultured in MT medium supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2.4D 0.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L and summer shoots in MT mediuin supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2，4D 4.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L. The calluses underwent good proliferation in MT medium supplied 6BA 0.25 mg/L and NAA 0.2 mg/L. MT medium with 6BA 0.25 mg/L and IBA 0.3 mg/L was favourable for redifferentiation and 1/2MT medium with NAA 4 mg/L resulted in the formation of strong roots.[Conclusion] The study laid foundation for rapid seedling breeding， detoxification technology.

Key words Tissue culture； Uniform design； Poncirus trifoliate（L.） Raf

基金項目肇慶學(xué)院柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)應(yīng)用與創(chuàng)新團隊建設(shè)項目；肇慶市科技計劃項目（2012N001）；肇慶學(xué)院協(xié)調(diào)創(chuàng)新基地建設(shè)項目（201401）。

作者簡介郭雁君（1973-），男，山西左云人，講師，碩士，從事遺傳育種研究。通訊作者，教授，博士，從事果樹學(xué)研究。

收稿日期20140423枳殼（Poncirus trifoliata（L.） Raf） 為蕓香科植物，其幼果及近成熟果實入藥，具有行氣、散結(jié)、消痰、除痞的功效。枳殼是柑橘中很好的砧木，能使樹體前期矮化，早結(jié)、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，且抗腳腐病、流膠病和抗線蟲。枳殼也是廣東省肇慶地區(qū)主栽柑橘品種砂糖橘和貢柑的首選砧木品種。枳殼通過實生播種繁育，具有繁殖率低、出苗不整齊和受季節(jié)限制等缺點。利用組織培養(yǎng)進行快速繁殖可克服常規(guī)方法的缺點，且在無病毒苗木繁育技術(shù)體系中，同樣需要利用枳殼的無菌苗作為莖尖微嫁接的砧木材料。枳殼組織培養(yǎng)研究工作主要是砧木實生苗的快繁技術(shù)，通過對莖尖、剝?nèi)シN皮的種子、花藥和枳根分生組織等的離體培養(yǎng)，得到再生植株；對枳胚珠、上胚軸等外植體進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚狀體和愈傷組織[1-4]。筆者運用均勻設(shè)計[5]，探討了在離體培養(yǎng)條件下不同取材時期、不同取材部位枳殼外植體的愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化及生根情況，旨在建立枳殼離體培養(yǎng)再生體系，為枳殼快速繁殖、脫毒技術(shù)和相關(guān)細(xì)胞工程的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料 供試材料為枳殼6年生實生樹的春梢（莖尖、莖段）、夏梢（莖尖、莖段）、秋梢（莖尖、莖段）和冬梢上含芽莖段。

1.2試驗方法

2.2愈傷組織的繼代培養(yǎng)和增殖

3結(jié)論與討論

研究表明，用枳殼花藥、離體胚珠等作外殖體，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織[1]，該研究采用枳殼春梢、夏梢和秋梢的莖尖、莖段以及冬梢?guī)а康那o段為外植體，同樣誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。多數(shù)植物組織（器官） 皆可在人工控制的條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但不同取材部位對誘導(dǎo)愈傷組織的適應(yīng)性不同，同樣影響愈傷組織的器官發(fā)生能力。該研究結(jié)果表明，枳殼春梢、夏梢莖段易產(chǎn)生愈傷組織，其中產(chǎn)生的致密、綠色、 瘤狀愈傷組織的器官發(fā)生能力較強，同時因取材受季節(jié)性影響小，取材容易，數(shù)量大等優(yōu)點，在誘導(dǎo)愈傷組織的應(yīng)用中較之花藥、胚珠等外植體材料具有廣泛的實用價值，且可以利用器官發(fā)生能力強的愈傷組織進行再分化研究。

愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖主要受外植體、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境三大因素的調(diào)控，培養(yǎng)基種類和成分的研究以生長調(diào)節(jié)物質(zhì)研究的最多，誘導(dǎo)和保持愈傷組織生長所需生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度及比例與外植體本身的生理狀態(tài)及對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的敏感性有密切的關(guān)系[6]，這在該試驗中得到充分的驗證。

愈傷組織的不定芽及不定根的發(fā)生是植株再生的重要途徑。 愈傷組織類型、 培養(yǎng)基成分均對不定芽的發(fā)生有影響。該研究結(jié)果表明，枳殼愈傷組織中以致密、綠色、瘤狀愈傷組織的分化能力強。通過最優(yōu)分析獲得了分化培養(yǎng)生長調(diào)節(jié)因子的最優(yōu)配方。 一般細(xì)胞分裂素在愈傷組織分化培養(yǎng)中起重要作用，而生長素的作用則隨植物材料的不同而不同， 通常在一些植物中細(xì)胞分裂素與生長素的適當(dāng)比例有利于不定芽的產(chǎn)生。

芽的分化具有更明顯的促進作用。

同大多數(shù)植物相似，在枳殼上生長素的作用在不定根的發(fā)生中也起關(guān)鍵性作用， 基本培養(yǎng)基中無機鹽濃度的降低有利于生根。研究表明，在不含激素的培養(yǎng)基上枳殼無根苗即可形成不定根[7]， 該試驗結(jié)果與其相反，在無激素的MT或1/2MT培養(yǎng)基上， 枳殼無菌苗愈傷化，而在1/2MT+4 mg/L NAA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不定根短而粗壯。陳力耕[7]在添加10-5 mol/L NAA培養(yǎng)基上經(jīng)過15～20 d即發(fā)根成苗。但該試驗中枳殼組織培養(yǎng)物的生根仍存在問題，不定根的發(fā)生需經(jīng)過一次繼代培養(yǎng)后，才能達2～3 cm長，生根較慢，生根培養(yǎng)的條件仍需進一步的摸索。

均勻設(shè)計在五味子、柴胡、西瓜等的組織培養(yǎng)中已有應(yīng)用[8-10]，但在柑橘以及砧木上較少，該試驗運用均勻設(shè)計方法考慮了多種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對枳殼愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化的作用，并通過回歸分析給出了定量方程，通過最優(yōu)分析預(yù)測了優(yōu)化配方。均勻設(shè)計的特點是試驗點在試驗范圍內(nèi)充分“均勻分散”，每個因素每個水平只進行一次試驗且試驗次數(shù)與水平數(shù)相等，可以以較少的試驗次數(shù)研究多因素多水平的問題。以4因素6水平為例，正交設(shè)計要72次試驗而均勻設(shè)計僅需6次試驗，大大減少了試驗次數(shù)，提高了工作效率，降低了試驗成本。在組織培養(yǎng)研究中，特別是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)作用的研究中，需要研究的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和水平往往較多，降低試驗的復(fù)雜性對組培研究具有實際意義。該試驗通過6因素10水平較全面地考察了各因素對愈傷組織誘導(dǎo)作用的顯著程度，因水平設(shè)置多且范圍較寬， 能較準(zhǔn)確、較容易地確定生長調(diào)節(jié)劑的作用水平范圍，而避免了多次試驗，取得了較好的效果。

參考文獻

[1] 張進仁.枳胚珠的離體繁殖[J].中國柑桔，1985（1）：22-23.

[2] 趙惠祥，黃啟風(fēng).枳殼花藥離體培養(yǎng)分化出單倍體植株[J].國外農(nóng)學(xué)（果樹），1981（2）：43-44.

[3] 賀紅.枳殼組織培養(yǎng)和植株再生研究[J].中草藥，1998，29（12）：824-825.

[4] 楊春霞，朱培林，黃小春.中藥“枳殼”的組織培養(yǎng)與植株再生[J].亞熱帶植物科學(xué)，2009，38（1）：66.

[5] 方開泰.均勻設(shè)計-數(shù)論方法在試驗設(shè)計中的應(yīng)用[J].應(yīng)用數(shù)學(xué)學(xué)報，1980，3（4）：363-372.

[6] 馬燕，韓瑞超，臧德奎，等.木本觀賞植物組織培養(yǎng)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：1956-1958，2023 .

[7] 陳力耕.柑桔實生苗大量增殖研究[J].亞熱帶植物通訊，1990（2）：40-45.

[8] 張佳，金東淳，金海林，等.均勻設(shè)計法優(yōu)化北五味子愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（12）：6977-6978，6987.

[9] 張東向，徐爽，史紹林，等.不同激素配比對三島柴胡懸浮細(xì)胞生長發(fā)育的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（26）：12864-12865，12895.

[10] 劉麗敏，劉紅堅，余坤興.甘蔗新品種桂糖02-1156均勻設(shè)計組培快繁[J].中國糖料，2014（1）：8-11.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（21）：6941，6977