楊靜 孫皓

摘要 [目的]研究水楊酸、茉莉酸甲酯、硝酸銀、高糖、高鹽、超聲等誘導子對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響。[方法]向細胞懸浮液中加入各種誘導子或?qū)毎麘腋∫哼M行超聲處理，測定細胞干重增殖倍數(shù)和黃芪多糖的合成量。[結(jié)果]加入10.0 mg/L水楊酸可使黃芪多糖的含量為對照組的2.04倍；添加較低濃度的茉莉酸甲酯濃度（1.0 mg/L）使黃芪多糖的含量達48.974 mg/g，比對照提高了2.50倍；添加4 mg/L濃度的硝酸銀能使黃芪多糖含量提高1.60倍；高糖和高鹽脅迫處理均能誘導黃芪多糖的合成。高糖處理能使黃芪多糖的產(chǎn)量比對照提高了1.92倍。低劑量的超聲刺激對黃芪細胞生物量的積累有顯著的刺激作用。[結(jié)論]誘導子的添加可有效促進黃芪懸浮培養(yǎng)細胞中黃芪多糖的積累。

關(guān)鍵詞 誘導子；黃芪多糖；積累；細胞懸浮培養(yǎng)；黃芪

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-08954-03

Effect of Different Elicitors on Accumulation of Astragalus Polysaccharides in the Suspension Culture Cell of Astragalus membranaceus

YANG Jing et al

（Tianjin Bohai Vocational and Technical College， Tianjin 300402）

Abstract [Objective] To investigate the effects of different elicitors （salicylic acid， methyl jasmonate， silver nitrate， high sucrose， high salt， ultrasonic stimulation） on the cell growth and inducible formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells. [Method] The suspension culture cells were treated with the elicitors or ultrasonic stimulation. Then the cell growth rate and the astragalus polysaccharides content in Astragalus membranaceu cells were determined. [Result] 10.0 mg/L salicylic acid resulted in an increase of astragalus polysaccharides content by about 2.04 times. With the addition of methyl jasmonate， the highest content of astragalus polysaccharides reached 48.974 mg/g ， and it was 2.50 times higher than the contol. The addition of 4 mg/L silver nitrate promote astragalus polysaccharides content by 1.60 times. Both the high sucrose and high salt treatment could induce the synthesis of astragalus polysaccharides. With the high sucrose treatment， the astragalus polysaccharides content was increased by 1.92 times. Low dose of ultra sonic stimulation can significantly stimulate the cell growth. [Conclusion] The addition of the elicitors was effective to enhance the formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells.

Key words Elicitors；Astragalus polysaccharides； Accumulation； Suspension culture cell； Astragalus membranaceus

黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.）是豆科多年生草本植物，根是中藥的中藥材，主產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙和山西等地。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為，黃芪具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功能^[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有增強機體免疫功能、強心降壓、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。黃芪被廣泛應用于臨床配伍或日常保健，位列40種大宗藥材品種的前10名。黃芪含有皂苷、黃酮、多糖和氨基酸等多種成分，其中黃芪多糖（Astragalus Polysaccharides，APS）是含量最多的主要活性成分，在黃芪藥理作用中起決定性作用。APS具有促進免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗衰老、抗寄生蟲等多種生物活性^[2]。近年來，由于人類對黃芪掠奪性開發(fā)，有限的野生資源遠不能滿足人們的需求，而傳統(tǒng)栽培又受季節(jié)、氣候、病蟲害的影響，不能滿足黃芪市場需求，黃芪資源短缺嚴重制約其廣泛應用。采用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物有效成分，具有高效、迅速和季節(jié)限制性小及保護生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點，是解決藥材資源問題的有效途徑之一。

目前，關(guān)于黃芪組織培養(yǎng)研究的報道比較多，已建立了穩(wěn)定的愈傷組織培養(yǎng)體系^[3]，而利用誘導子的添加對黃芪懸浮細胞中黃芪多糖含量影響的研究，尚未見報道。該試驗主要考察水楊酸、茉莉酸甲酯、硝酸銀、高糖、高鹽、超聲等誘導子對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響，旨在為黃芪細胞大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪種子（北京時珍中草藥研究所），經(jīng)樂仁堂制藥廠中心化驗室鑒定為Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.的種子。黃芪多糖對照品、葡萄糖對照品購自中國藥品生物制品檢定所。水楊酸、茉莉酸甲酯、硝酸銀、甘露醇和氯化鉀等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

HPG-280B強光照培養(yǎng)箱；TCYQ ZYSA0351型超大型搖床；BCN-1360型凈化工作臺；Sartorius BS 2202S型電子天平；UV- 7500紫外分光光度計；202型電熱恒溫干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 黃芪無菌苗的獲得。

選擇飽滿的黃芪種子于70%的乙醇中浸泡1 min，用無菌水沖洗2次，然后用2%次氯酸鈉溶液進行表面消毒30 min后，用無菌水浸洗5次。將已滅菌的種子接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為MS+3%蔗糖+1%瓊脂、pH 5.8、光照16 h培養(yǎng)，4～5 d后種子萌發(fā)，20 d后試管苗長勢良好。

1.3.2 愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)。

取黃芪無菌苗的幼嫩葉片，自來水沖洗干凈，75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl₂消毒7 min，然后無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干水分，切成0.5 cm2的小塊，接種到誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+3%蔗糖+1%瓊脂、pH 5.8，采用黑暗培養(yǎng)，（24±1）℃，挑選生長良好的愈傷組織，稱重后繼代培養(yǎng)，每四周繼代一次，繼代培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L 6-BA，其他同誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同前。

以上培養(yǎng)基接種前須經(jīng)高壓滅菌，滅菌溫度121 ℃，滅菌時間20 min。

1.3.3 黃芪細胞株的獲得。

將愈傷組織（約2 g鮮重）轉(zhuǎn)移到含50 ml液體的培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+3%蔗糖，pH5.8）的250 ml錐形瓶中懸浮培養(yǎng)，每15 d繼代一次，在繼代培養(yǎng)過程中，將大塊尚未分散的愈傷組織去除，同時去除褐化的愈傷組織，懸浮培養(yǎng)時，搖床的轉(zhuǎn)速為120 r/min，（22±1）℃，暗培養(yǎng)。

1.3.4 黃芪懸浮培養(yǎng)細胞誘導子處理。

茉莉酸甲酯用無水乙醇溶解，配成試驗用濃度的溶液，經(jīng)0.22 μm過濾除菌；水楊酸、硝酸銀、甘露醇和氯化鉀用蒸餾水溶解，配成試驗用濃度的溶液，高壓滅菌。

1.3.5 誘導子添加試驗。

在培養(yǎng)的第4天（指數(shù)生長期之前）向培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的水楊酸（0.1、1.0、10.0 mg/L）、茉莉酸甲酯（0.1、1.0、10.0 mg/L）、硝酸銀（2、4、8 mg/L）以及高鹽（250 mmol/L KCl）、高糖（25 g/L甘露醇）和超聲處理5 min（300 Hz/min），再培養(yǎng)14 d，即第18天收獲黃芪細胞。培養(yǎng)基pH 5.8，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，每組重復3～4瓶，以未添加誘導子的組分作為對照。

1.3.6 生物量的測定。

將懸浮細胞液置于離心管中，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細胞2～3次，棄去上清液，稱得沉淀細胞質(zhì)量，即為細胞鮮重，置于烘箱中60 ℃干燥7～8 h以至恒重，稱其質(zhì)量為細胞干重。干重增殖倍數(shù)=（收獲時細胞干重-接種時細胞干重）/接種時細胞干重。

1.3.7 黃芪多糖的含量測定。

1.3.7.1 樣品溶液的制備^[4]。

將黃芪細胞培養(yǎng)物50 ℃下烘干至恒重，粉碎，準確稱取1.500 g，用濾紙包好置索氏提取器中加入70%的乙醇提取3 h，揮干濾紙包中的乙醇，放于小燒杯中加入20倍量的去離子水超聲，提取110 min。水提液濃縮定容于25 ml的容量瓶中備用。

1.3.7.2 對照品溶液的制備 。

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的 D-無水葡萄糖100 mg，置100 ml量瓶中加水溶解，定容至刻度，搖勻即得1 μg/ml的對照品溶液。

1.3.7.3 黃芪多糖含量測定方法。

精密吸取空白對照品和供試品溶液各2 ml于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速加入5.0 ml濃硫酸，振搖 2 min，置沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水為空白對照，在490 nm 處測定吸光度。根據(jù)回歸方程，計算出相應濃度。試驗所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示。

1.3.7.4 標準曲線繪制。

分別精密吸取的對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml的溶液于25 ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，精密吸取上述各溶液2 ml于具塞試管中，按照“1.3.7.3”方法測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸，得回歸方程 A=68.703C+0.025 1（r=0.999 5），結(jié)果表明，葡萄糖在2.0～14.0 μg/ml線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對黃芪細胞生長及黃芪多糖積累的影響

從誘導子水楊酸的添加對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響（表1）可以看出，在細胞生長指數(shù)期前添加水楊酸濃度較低時（0.1、1.0 mg/L），水楊酸對黃芪細胞生長的影響與對照組相比無顯著影響；添加高質(zhì)量濃度水楊酸（10.0 mg/L）時，黃芪細胞干重為對照組的70.85%?？梢?，較高濃度的水楊酸則會抑制黃芪細胞生長。隨著水楊酸質(zhì)量濃度的增加，黃芪多糖的含量也逐漸增加；當水楊酸濃度達10.0 mg/L時，黃芪多糖的含量顯著增加，達到對照組的2.04倍。由此可見，當水楊酸在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)，誘導產(chǎn)物合成效果逐漸提高，但隨著水楊酸濃度的增加，其對細胞毒害也逐漸加強，細胞干重明顯下降。分析原因一方面可能是水楊酸的添加導致細胞活力下降甚至死亡；另一方面，水楊酸添加又激活了黃芪多糖合成代謝途徑中某些酶，進而提高黃芪多糖的合成速率。可見，只有在適宜的誘導子濃度下，找到細胞生物量的下降與黃芪多糖含量的提高之間的平衡點，才能獲得較好的誘導效果。

2.2 茉莉酸甲酯對黃芪細胞生長及黃芪多糖含量的影響

茉莉酸甲酯是激發(fā)次生代謝物積累的常用誘導子之一，不同植物懸浮培養(yǎng)體系中加入茉莉酸甲酯后能夠誘導細胞中次生代謝物積累增加^[5]。由茉莉酸甲酯對黃芪細胞生長及黃芪多糖含量的影響（表2）可見，隨添加入茉莉酸甲酯濃度的增加，細胞干重逐漸降低；當茉莉酸甲酯濃度達10.0 mg/L時，細胞干重降為對照組的68.74%。可見，茉莉酸甲酯的添加對黃芪細胞生長一定的抑制作用。茉莉酸甲酯對黃芪的積累有明顯的促進作用。添加1.0 mg/L茉莉酸甲酯可使黃芪多糖的含量達48.974 mg/g，達到對照組的2.50倍；隨著加入茉莉酸甲酯濃度的增加，對黃芪多糖積累的促進作用逐漸減弱；當加入的茉莉酸甲酯的質(zhì)量濃度達10.0 mg/L，細胞中黃芪多糖的含量與對照組相比已沒有明顯提高。由此可以推斷，較低的茉莉酸甲酯濃度（1.0 mg/L）更有利于黃芪細胞中黃芪多糖的積累。

2.3 硝酸銀對黃芪細胞生長及黃芪多糖含量的影響

從硝酸銀對黃芪細胞的生長和黃芪多糖的合成的影響（表3）可以看出，各組試驗中，黃芪細胞干重均有所下降，可見硝酸銀對黃芪細胞生長沒有多大益處，甚至阻礙了黃芪細胞的影響。而硝酸銀濃度較低為2 mg/L時，黃芪多糖的產(chǎn)量與對照組接近；當硝酸銀濃度達4 mg/L時，黃芪多糖的含量達到最大值，為對照組的1.60倍；但在高濃度8 mg/L的硝酸銀下，黃芪多糖的合成受到了抑制，僅為對照組的36.58%，這可能是高濃度銀離子毒性所造成的。綜合分析，4 mg/L濃度的硝酸銀最有利于黃芪多糖的積累。

3 討論

植物次生代謝過程中，誘導子作為一種特殊的生化信號，能快速、專一和有選擇地誘導某些特定基因的表達，從而提高代謝途徑中相關(guān)酶的活性，進而促進或抑制細胞中該酶調(diào)控的次生代謝產(chǎn)物的合成^[7]。通過添加外源誘導子改變植物次生代謝途徑，是提高植物次生代謝產(chǎn)物的有效方法之一。

水楊酸和茉莉酸甲酯是植物的信號分子，可參與細胞內(nèi)和細胞間信號傳導，誘發(fā)細胞的防御反應，并激活細胞內(nèi)多種酶的活性，促進次級代謝產(chǎn)物合成。Dong等采用水楊酸做誘導子促進了丹參細胞中酚類化合物積累，并激活抗氧化物的活性^[8]。而Angeles等向水飛薊細胞懸浮培養(yǎng)體系中加入了MJ發(fā)現(xiàn)水飛薊素大量積累^[9]。該試驗以水楊酸和茉莉酸甲酯作為誘導子，二者均能在一定程度上抑制黃芪細胞生長和有效提高黃芪中黃芪多糖的含量，這與孫鎮(zhèn)等的研究結(jié)果^[10]一致。水楊酸和茉莉酸甲酯影響黃芪多糖合成的最佳作用濃度不同，水楊酸最佳作用濃度為10.0 mg/L，而茉莉酸甲酯最佳作用濃度為1.0 mg/L，茉莉酸甲酯誘導效果優(yōu)于水楊酸。重金屬離子對細胞培養(yǎng)合成次生代謝產(chǎn)物的影響可能是由于引起或促進了與植物防御機制有關(guān)的特異的次生產(chǎn)物合成途徑^[11]，如王傳貴等研究表明一定濃度的硝酸銀能促進中國紅豆杉細胞中紫杉醇的合成^[12]。另有報道，AgNO₃不但能促進人參毛狀根中總皂苷含量和單體皂苷的積累，還能促進人參皂苷的外泌^[13]。高鹽脅迫可以改變細胞內(nèi)外滲透壓，有研究指出提高滲透壓可以提高人參懸浮細胞中皂苷的含量^[14]。低強度的超聲可以提高細胞膜的通透性，利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物進出細胞^[15]。因此，超聲常作為非生物誘導子用于細胞懸浮培養(yǎng)中提高次級代謝產(chǎn)物的含量。LIN等研究發(fā)現(xiàn)低劑量超聲能促進人參細胞生物量的增加和人參皂苷的合成^[15]。

此外，誘導子的誘導效果不僅與誘導子的添加濃度有關(guān)，還與誘導子的添加時間有關(guān)。細胞接受外界刺激，調(diào)節(jié)自身代謝與它所處的生長時期有關(guān)。只有處于一定生長時期的細胞才能有效地接受誘導子信號，此時誘導子才能表現(xiàn)出最強的活性。Veeresham提出在指數(shù)生長期前加入誘導子對次生代謝產(chǎn)物合成最有利^[16]。因此，試驗在細胞到達指數(shù)期前即第5天添加誘導子，類似的報道可見于 MJ 誘導子誘導葡萄細胞誘導合成花青素^[17]。當然，其他的添加時間對黃芪細胞生長及其黃芪多糖積累的影響也待進一步研究。

除了誘導子的種類、濃度和添加時間影響植物細胞生長外，許多試驗表明，誘導子之間存在著協(xié)同效應，如孫健玲等研究表明非生物和生物誘導子協(xié)同作用對半夏細胞生長和總生物堿的積累有促進作用^[18]。該試驗僅考慮了誘導子的單因素作用，多種誘導子之間的協(xié)同或拮抗作用還值得作進一步的考察。

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