張富東李玲牛艷芬高麗輝林華劉旭

（1樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000；2樂(lè)山老年病專(zhuān)科醫(yī)院；3昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南 昆明 650500）

烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

張富東1，2李玲3牛艷芬3高麗輝3林華3劉旭3

（1樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000；2樂(lè)山老年病專(zhuān)科醫(yī)院；3昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南 昆明 650500）

目的：探討烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法：通過(guò)建立體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，對(duì)烏墨根部提取物進(jìn)行活性篩選，并對(duì)化合物濃度與抑制活性關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果：粗提物12，17，21在體外對(duì)α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制活性，其中粗提物21的抑制活性（IC50=94.89 μg/mL），遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的抑制活性（IC50=1 095.65 μg/mL）。結(jié)論：烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制活性，具有一定的潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值。

烏墨；提取物；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

烏墨（Syzygiumcumini，Eugeniajambolana，Syzynium jambolana）又名烏楣、野冬青果，系桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬植物。為高大喬木，高 6～20 m，小枝圓柱形或稍壓扁，葉片革質(zhì)，寬橢圓形至長(zhǎng)圓狀橢圓形，長(zhǎng) 5～ 12 cm，寬 3～ 7 cm；葉柄長(zhǎng)1.5～ 2 cm，圓錐花序通常生于落葉的腋內(nèi)，偶有頂生，長(zhǎng)8～ 11 cm，多花；花梗短；花白色，芳香，常3～ 5朵生于花序小枝頂端；花蕾倒卵形，長(zhǎng)約5 mm，萼管倒錐形，長(zhǎng)約5 mm；果實(shí)卵形或壺形，長(zhǎng)1～ 2 cm，寬0.5～ 1 cm；種子1顆；花期4～ 5月，果期 6～ 8月。生長(zhǎng)于海拔 500～ 1 800 m的山坡次生林內(nèi)，在云南南部、廣東、廣西、海南、福建、臺(tái)灣、中南半島、喜馬拉雅山區(qū)諸國(guó)（尼泊爾等）、印度、印度尼西亞、澳大利亞均有分布。果實(shí)、莖皮、葉藥用，具有潤(rùn)肺、止咳、平喘的功效，我國(guó)民間主要用于治療肺結(jié)核、寒性哮喘和過(guò)敏性哮喘[1]。而在印度民間，烏墨則很早就被發(fā)現(xiàn)有治療糖尿病的功效[2]。

20世紀(jì) 60年代，法國(guó)科學(xué)家首次報(bào)道了烏墨種子的乙醇提取物具有降低四氧嘧啶性糖尿病大鼠血糖的作用。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)烏墨的種子、果實(shí)、樹(shù)皮和樹(shù)葉的化學(xué)成分及抗糖尿病的作用也進(jìn)行了相關(guān)研究[3-6]，但具體降糖機(jī)制還不是太清楚。而且大部分的活性研究?jī)H停留在烏墨種子、果實(shí)和樹(shù)皮的粗提物上，缺乏對(duì)于活性單體的研究，此外，對(duì)烏墨根部提取物的研究也較少。

結(jié)合國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)烏墨降糖機(jī)制的研究報(bào)道，筆者利用體外α-葡萄糖苷酶抑制高通量篩選模型對(duì)烏墨根部提取物進(jìn)行活性篩選，以期為烏墨根部提取物降糖機(jī)制研究和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Electron公司）；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；DELTA 320型 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LR4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó) Heidolph公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CS-H1型混合器（北京博勵(lì)陽(yáng)科技公司）；96微孔板；各種移液器及槍頭等。

1.2 試劑

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3.2.1.20)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516）、阿卡波糖（Acarbose，Lot 16869，純度≥95%）和二甲亞砜（DMSO）均購(gòu)自Sigma公司；烏墨根部提取物樣品（共7個(gè)單體化合物，17個(gè)粗提物）是由昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供，見(jiàn)表1。

表 1 烏墨根部提取物的化學(xué)式及分子量

2 方法

2.1 α-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定[7]

40 μL磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），加入0.025 U/mL的α-葡萄糖苷酶20 μL、37℃恒溫10 min后加入1.25 mmol/L的PNPG 20 μL，37℃恒溫反應(yīng)15 min。再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL，于400 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值（OD）。

2.2 烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

本檢測(cè)在96孔板上進(jìn)行，反應(yīng)體系參照李婷等[7]的方法，探索最佳α-葡萄糖苷酶和PNPG的濃度，最佳反應(yīng)時(shí)間以及最適緩沖液，實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化后為：磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）20 μL，加入0.025 U/mL的 α-葡萄糖苷酶 20 μL，樣品溶液20 μL，37℃恒溫 10 min，加入 1.25 mmol/L的PNPG 20 μL，37℃恒溫反應(yīng)15 min，再加入80 μL 0.2 mol/L的 Na2CO3溶液，于 400 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組，每組3孔，分別為：a對(duì)照組（緩沖液＋酶液＋底物）；b空白組對(duì)照組（緩沖液）；c樣品測(cè)定組（樣品＋酶液＋底物）；d樣品對(duì)照組（樣品＋緩沖液）；e陽(yáng)性對(duì)照組（Acarbose＋酶液＋底物）。

按下面方法計(jì)算抑制率，并用GreatBasic軟件求出相應(yīng)IC50值：

I%=[1-（c-d）/（a-b）]×100%。

3 結(jié)果

3.1 各提取物的抑制活性

烏墨根部各提取物在質(zhì)量濃度為 200 μg/mL時(shí)粗提物 12（13.56%），17（9.87%），21（87.58%）對(duì)α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出一定的抑制活性，特別是化合物 21的抑制率（87.58%）遠(yuǎn)高于阿卡波糖（17.68%），表明烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性。為進(jìn)一步研究抑制活性的高低，對(duì)化合物21的初篩終濃度依次對(duì)半稀釋計(jì)算IC50值，算出 IC50為 94.89 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照Acarbose的IC50（1 095.65 μg/mL）。結(jié)果表明，烏墨根部提取物具有一定的抑制活性，遠(yuǎn)大于阿卡波糖的抑制活性。烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性見(jiàn)表2。

3.2 提取物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

粗提物12，17，21對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈劑量依賴(lài)性，其中粗提物 21在質(zhì)量濃度＜ 500 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了最大值100%，此后再增加提取物濃度抑制率也不再變化，粗提物12和17在質(zhì)量濃度＜ 1 000 μg/mL時(shí)，抑制率已分別達(dá)到了最大值41.81%和31.89%，此后再增加提取物濃度抑制率也無(wú)任何變化，出現(xiàn)“平臺(tái)期”，其余提取化合物無(wú)論濃度高低對(duì)α-葡萄糖苷酶均未表現(xiàn)出抑制活性。阿卡波糖在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而增大。說(shuō)明烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性。烏墨根部提取物不同濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖1。

表2 烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖1 不同濃度烏墨根部提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

4 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種有效的口服降糖藥，對(duì)糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療有很好的效果，此外，α-葡萄糖苷酶抑制劑還能抑制蛋白及脂類(lèi)糖基化[8]，具有抗癌、抗 HIV、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[9]。目前臨床上廣泛應(yīng)用的 α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖、伏格列波糖等都有較好的療效，但也有不盡如人意之處。研究[10-11]表明植物中存在許多具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分，如杜仲[12]、穇子[13]、印度魚(yú)藤[14]、大豆[15]、虎杖[16]、知母[17]等均有良好的抑制 α-葡萄糖苷酶活性。由于藥用天然產(chǎn)物大多數(shù)結(jié)構(gòu)確定，作用溫和、緩慢與持久[18]，因而，從藥用植物中篩選天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。

研究結(jié)果表明，烏墨根部提取物具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，各提取物的抑制活性均與濃度呈正相關(guān)性，說(shuō)明其抑制活性具有劑量依賴(lài)性。進(jìn)一步的酶抑制作用的研究結(jié)果表明，粗提物 21的抑制活性最好，優(yōu)于阿卡波糖的抑制活性，說(shuō)明可以對(duì)該提取物進(jìn)行活性成分追蹤，作進(jìn)一步研究，為烏墨根部提取物的降糖機(jī)制研究和開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on Inhibition Effect of Syzygium cumini Extracts on the Activity of α-glucosidase

Zhang Fudong1，2，Li Ling3，Niu Yanfen3，Gao Lihui3，Lin Hua3，Liu Xu3（1 Leshan Vocational&Technical College，Sichuan Leshan 614000，China；2 Leshan Specialized Hospital of Geriatric Disease；3 Biomedical Engineering
Research Center of Kunming Medical University，Yunnan Kunming 650500）

Objective：To investigate the inhibition effect of the extracts from the root of Syzygium cumini on the activity of α-glucosidase.Methods：By establishing α-glucosidase screen inhibitory model，the activity of extracts from the root of Syzygium cumini was screened.The relationship between the inhibitory ratio and the extract concentration was also studied.Results：Compounds 12，17，21 showed a good inhibitory effect on the activity of α-glucosidase，and the inhibitory effect of compound 21（IC50=94.89 μg/mL）was much higher than that of the positive control of acarbose （IC50=1 095.65 μg/mL）.Conclusion：The extracts from the root of Syzygium cumini have inhibition effects on the activity of α-glucosidase，and presented a certain potential value in the development and utilization.

Syzygium cumini；Extract；α-glucosidase；Inhibitory Activity

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.12.007

2014-08-21）

樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No KY2014019）

張富東，男，碩士，助教。研究方向：內(nèi)分泌代謝藥理。E-mail：441445988@qq.com