鄭敬民，尹 廣，劉志紅

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南京 210002）

膜性腎病是導(dǎo)致成人腎病綜合征的一個(gè)常見原因。在我國，膜性腎病約占原發(fā)性腎小球腎炎的10%[1]。在西方，膜性腎病的比例則高達(dá)30%[2]。但有關(guān)膜性腎病的病理機(jī)制仍不是很清楚。

近年來，有關(guān)肥大細(xì)胞在各種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中的可能作用引起了不少研究者的關(guān)注。包括膜性腎病在內(nèi)的各種主要腎臟病患者腎組織中，均存在肥大細(xì)胞增多的現(xiàn)象[3?9]。但目前對(duì)腎組織肥大細(xì)胞的確切病理意義仍不了解。從已有的文獻(xiàn)來看，針對(duì)特定腎臟疾病腎組織肥大細(xì)胞的研究仍然不多，病例數(shù)也很有限，尤其是在國內(nèi)，這方面的文獻(xiàn)更少（就我們查閱的文獻(xiàn)來看，尚未見國內(nèi)有相關(guān)報(bào)道）。就膜性腎病而言，國外文獻(xiàn)只籠統(tǒng)地報(bào)道了患者腎組織肥大細(xì)胞增多的現(xiàn)象，尚未見對(duì)不同病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞的分類比較分析。本文對(duì)包括Ⅰ～Ⅳ期在內(nèi)的不同病理類型膜性腎病患者腎組織中的肥大細(xì)胞及其與某些臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行了定量分析，以比較全面地了解我國患者（漢族人）腎組織肥大細(xì)胞的分布特點(diǎn)，探討肥大細(xì)胞在膜性腎病發(fā)生發(fā)展中的可能病理意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例選擇及相關(guān)病理資料的獲取

從南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所腎活檢組織標(biāo)本庫中選取臨床和病理資料完整的特發(fā)性膜性腎病病例55例（Ⅰ～Ⅳ期分別為5例、26例、16例和8例）。所有病例的腎活檢組織均經(jīng)光鏡、免疫熒光和電鏡分析，符合有關(guān)特發(fā)性膜性腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。同時(shí)選取8例移植供腎組織標(biāo)本作為正常對(duì)照，所選供腎組織病理分析均顯示無明顯病變。所有臨床相關(guān)資料（包括生化檢測結(jié)果等）從有關(guān)病歷資料庫中獲取。本文所有研究均遵守《赫爾辛基宣言》原則，并獲得本單位倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 腎組織肥大細(xì)胞檢測和定量計(jì)數(shù)方法

根據(jù)腎組織肥大細(xì)胞特異性高表達(dá)C3aR的特點(diǎn)[11,12]，以免疫組化的方法標(biāo)記腎組織中的肥大細(xì)胞。光鏡下攝取皮質(zhì)區(qū)圖像，計(jì)錄每張切片腎組織皮質(zhì)區(qū)中的肥大細(xì)胞數(shù)；同時(shí)利用NIS Element BR軟件測量每張切片皮質(zhì)區(qū)的腎組織面積；得到每平方毫米腎組織（皮質(zhì)區(qū)）肥大細(xì)胞平均數(shù)（肥大細(xì)胞密度）。

1.3 免疫組化染色方法

腎活檢組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和復(fù)水處理后，于高壓鍋中高壓進(jìn)行抗原修復(fù)；以3%過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶；以10%胎牛血清封阻30min；經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次（5min/次）后，與兔抗人C3aR多克隆抗體（Santa Cruz公司）于4℃孵育過夜；再經(jīng)PBS洗滌3次（5min/次）后，加Envision試劑（Dako公司）室溫孵育45min；第三次PBS洗滌后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)，然后以蘇木素復(fù)染1min，自然風(fēng)干后封片觀察。

1.4 小管間質(zhì)相對(duì)體積測量方法

參照Okon等[13]介紹的方法，每張切片隨機(jī)選取皮質(zhì)區(qū)10個(gè)區(qū)域，利用NIS Element BR3.4軟件（Nikon，Japan）測量每個(gè)區(qū)域中的小管間質(zhì)面積和區(qū)域中不含小球的面積，計(jì)算出小管間質(zhì)面積所占的比例，以平均值代表每張切片的相對(duì)小管間質(zhì)體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于數(shù)據(jù)的正態(tài)性不佳，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，同時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行校正。相關(guān)性分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肥大細(xì)胞在膜性腎病患者腎組織中的分布定位

免疫組化分析顯示（圖1），肥大細(xì)胞主要分布在膜性腎病患者腎組織的皮質(zhì)及皮髓交界區(qū)，與皮質(zhì)區(qū)相比，髓質(zhì)中肥大細(xì)胞的數(shù)量明顯要少得多。在皮質(zhì)區(qū)，肥大細(xì)胞主要以一種松散的方式分布于小管間質(zhì)中，常出現(xiàn)在小管間質(zhì)增寬的區(qū)域，分布于萎縮的小管和損傷小球的周圍。多數(shù)情況下，肥大細(xì)胞并不與小管間質(zhì)中其他炎癥細(xì)胞扎堆分布（圖1B-D），在有大量炎癥細(xì)胞浸潤的區(qū)域，肥大細(xì)胞的數(shù)量往往不多。雖然在絕大多數(shù)膜性腎病患者的腎小球中觀察不到肥大細(xì)胞，但在少數(shù)病例的一些小球（在我們所分析的55例中的5例），可見肥大細(xì)胞侵入腎小球的情況（圖1E-F），這與我們以前在糖尿病性腎病和IgA腎病等觀察到的情況有所不同（以前在腎小球中從未觀察到肥大細(xì)胞）[8,9]。在不同病理類型的膜性腎病腎組織中，沒有觀察到肥大細(xì)胞在分布方式上有明顯差異。

2.2 不同病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

正常對(duì)照腎組織中極少發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，各種病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞數(shù)量（密度）均有不同程度的增加。Ⅰ期膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少，而其他病理類型間的差異并不顯著（圖2）。

2.3 膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

基于雙變量Person模型相關(guān)分析顯示，膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞數(shù)量（密度）與患者血肌酐水平（r＝0.464，P＜0.001）、血胱抑素C（cystatin C，Cys C，r＝0.464，P＜0.01）、尿視黃醇結(jié)合蛋白（retinol-binding protein，RBP，r＝0.322，P＝0.024）、尿N-乙?；?β-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG，r＝0.453，P＜0.001）、尿α微球蛋白（r＝0.351，P＝0.013）、尿C3水平（r＝0.334，P＜0.018）、以及小管間質(zhì)相對(duì)體積具有顯著相關(guān)性（r＝0.636，P＜0.001），其中以與小管間質(zhì)相對(duì)體積的相關(guān)性最高。而與24h尿蛋白、尿溶菌酶水平，以及性別等沒有顯著相關(guān)性。

圖1 肥大細(xì)胞（黑色箭頭所示）在不同病理類型膜性腎病患者腎組織中的分布情況Figure1 The distribution of mast cells (indicated by black arrows) in the renal tissue of patients with membranous nephropathy(×200)

圖2 不同病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞數(shù)比較Figure2 Comparison of renal mast cell number in patients with different pathological types of membranous nephropathy

3 討論

本文首次對(duì)我國（漢族人）膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞進(jìn)行了觀察，并與國際上首次對(duì)不同病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞進(jìn)行了比較分析。從我們的分析結(jié)果來看，在膜性腎病患者腎組織中，肥大細(xì)胞主要是以一種松散的方式分布于腎小管間質(zhì)，常出現(xiàn)在小管間質(zhì)增寬的區(qū)域，特別是萎縮的小管和損傷小球的周圍。這與肥大細(xì)胞在其他腎臟疾病中的分布相似[3?9]。但在本文，我們還在少數(shù)病例的一些腎小球中也觀察到了肥大細(xì)胞的存在，特別是在硬化小球中，有時(shí)可觀察到較多的肥大細(xì)胞浸潤。這是我們以前對(duì)其他疾病的分析中所從未見到的[8,9]。文獻(xiàn)上[3?7,14?16]。也未見有肥大細(xì)胞出現(xiàn)在腎小球中的報(bào)道。但這是否是膜性腎病特有的病理現(xiàn)象，以及產(chǎn)生這一病理現(xiàn)象的原因，仍有待于進(jìn)一步的研究?；谀ば阅I病的病理分類分析顯示，不同病理類型膜性腎病的腎組織肥大細(xì)胞在分布方式上并未觀察到明顯的差異。與已往研究一致[3?9]，在本文中，我們觀察到正常腎組織中極少有肥大細(xì)胞。與正常對(duì)照相比，膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。相對(duì)而言，Ⅰ期患者腎組織肥大細(xì)胞的數(shù)量較少，而其他組間的差異并不顯著。相關(guān)性分析顯示，膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞與反映腎功能損傷程度的指標(biāo)（血肌酐和Cys C）和小管間質(zhì)損傷指標(biāo)（包括NAG、尿視黃醇結(jié)合蛋白和小管間質(zhì)相對(duì)體積）具有顯著相關(guān)性。這些結(jié)果提示：（1）肥大細(xì)胞參與了膜性腎病患者腎組織損傷過程；（2）肥大細(xì)胞主要與小管和小管間質(zhì)損傷有關(guān)，可能在膜性腎病慢性化病變中起重要作用；（3）在一些特定生理情況下，肥大細(xì)胞可能與膜性腎病患者腎小球的損傷有關(guān)。

需要特別指出的是，在本文的研究中，我們對(duì)不同病理類型膜性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞進(jìn)行了分類分析，雖然總的病例數(shù)并不少，但涉及到每一病理類型的病例仍很有限，因此，對(duì)于不同病理類型中的情況，仍有待于進(jìn)一步擴(kuò)大每組病例數(shù)進(jìn)行觀察，以便得出更加可靠的結(jié)論。

總之，本文的研究結(jié)果提示，肥大細(xì)胞很可能參與了膜性腎病腎組織損傷，特別是小管間質(zhì)損傷的過程。肥大細(xì)胞作為一種新的致病因素以及一個(gè)潛在的膜性腎病腎組織慢性病變防治新靶標(biāo)，值得我們關(guān)注。

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