都 暖,張師愚,毛亞峰

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

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醋調(diào)吳茱萸貼劑制備及其體外透皮情況研究

都 暖,張師愚*,毛亞峰

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

目的：制備吳茱萸貼劑，并采用HPLC法研究加酸對(duì)吳茱萸堿體外透皮率的影響。方法：以PVP為主要基質(zhì)制備吳茱萸貼劑，以SD大鼠離體腹部皮膚為透皮屏障，利用TK-20B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，采用HPLC方法進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)加酸和不加酸吳茱萸兩種貼劑的吳茱萸堿透皮率進(jìn)行比較。結(jié)果：制得吳茱萸貼劑，且加酸貼吳茱萸堿的累計(jì)透過率明顯高于不加酸貼。結(jié)論：采用浸膏方法制備吳茱萸成貼劑是可行的，且其中加酸貼吳茱萸堿具有良好的體外透皮釋放性能。

吳茱萸堿；貼劑；透皮量

吳茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.)為蕓香科植物吳茱萸干燥的近成熟果實(shí)，為常用中藥材，該藥物使用歷史悠久，在我國分布廣泛，資源豐富。吳茱萸的主要活性成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，歷代本草記載吳茱萸具有溫中、止痛、殺蟲、止嘔、止瀉等功效[1]。近年來, 隨著穴位貼敷療法研究的開展與深入, 吳茱萸貼敷涌泉穴取得一定的進(jìn)展，且對(duì)高血壓、失眠、口腔潰瘍、小兒消化不良等病癥[2]均具有一定療效。采用吳茱萸粉末調(diào)醋涌泉穴敷貼法治療心因性失眠癥臨床效果明顯[3]。王森等[4]采用醋調(diào)吳茱萸粉末進(jìn)行體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)，證明醋調(diào)吳茱萸粉末所含的吳茱萸堿和吳茱萸次堿均具有良好的體外透皮釋放性能。因此，本文將吳茱萸浸膏加醋酸制作成貼劑，并采用HPLC法研究比較加酸和不加酸貼劑對(duì)吳茱萸堿體外透皮率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；泵：LC-20AT 二元泵；檢測(cè)器：SPD-20A紫外檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-20A；TK-20B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；RE-50A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.1.2 材料 吳茱萸(產(chǎn)地江西，天津市中藥飲片廠有限公司，批號(hào)：1211055)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物與鑒定教研室馬琳老師鑒定為蕓香科植物吳茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth．)的干燥近成熟果實(shí)；吳茱萸堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11802-200606)；聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP,天津市博迪化工有限公司)；甘油(丙三醇,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；冰醋酸，乙醇，水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；SD大鼠，雄性，體重(200±15)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 吳茱萸浸膏制備 將吳茱萸原料藥采用粉碎機(jī)粉碎。 稱取粉碎完全的吳茱萸粉末30g，置于500mL圓底燒瓶，加入8倍85%乙醇，于70℃水浴回流2h，減壓抽濾，棄藥渣，取濾液旋蒸并回收乙醇。濾液剩余100mL即轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴加熱取出多余乙醇液，可得浸膏，稱重6.1g。1.2.2 貼劑制備

(1)加酸吳茱萸貼劑制備。 稱取吳茱萸浸膏0.3g(相當(dāng)于生藥1.5g)置于蒸發(fā)皿中，加入3mL醋酸[4]攪拌均勻，置于水浴鍋干燥，揮去酸味，得粉末0.2g。將粉末置于小燒杯中，用5mL乙醇溶解，備用。另取PVP和甘油各2.5g置于燒杯，加入適量水?dāng)嚢杈鶆?，再將備用藥液分次倒入燒杯，攪拌均勻，采用保鮮膜封口，使其充分溶脹(8h以上)。第2天將溶脹好的膏體倒于玻璃紙上(6cm×8cm)，自然干燥。干燥后加蓋無紡布背襯層。

(2)不加酸吳茱萸貼劑制備。 稱取吳茱萸浸膏0.3g至小燒杯，不加酯酸，按上述貼劑制作方法，制備不加酸吳茱萸貼。

1.2.3 兩種貼劑吳茱萸堿含量測(cè)定

(1)HPLC色譜條件。 色譜柱：KromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈—水(51∶49)；柱溫：室溫；流速1mL·min-1；檢測(cè)波長：225nm；

(2)對(duì)照品溶液制備。 精密稱定吳茱萸堿對(duì)照品1.58mg，用甲醇濃度定容至25mL容量瓶中，得濃度為63.2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，備用。

(3)供試品溶液制備。 取兩種吳茱萸貼劑各1片，均剪取面積為1cm2的貼片，除去蓋襯，選用50mL甲醇回流溶解。取甲醇回流液1.5mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，至液相自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中，備用。

1.2.4 吳茱萸經(jīng)皮給藥貼劑體外透皮實(shí)驗(yàn)

(1)離體皮膚制備。 將SD大鼠處死后，立即剝離腹部皮膚，用剃毛器脫毛,并去皮下脂肪，用生理鹽水洗凈置冰箱于4℃保存，備用。

(2)試驗(yàn)條件。 采用立式Franz擴(kuò)散池(體積：6mL,擴(kuò)散面積：2.54cm2)，水浴溫度為(37±1)℃，轉(zhuǎn)速為300r/min。將預(yù)處理皮膚置于擴(kuò)散室與接受室之間，在其角質(zhì)層表面貼上吳茱萸藥貼劑，固定，以生理鹽水∶85%乙醇(7∶3)為擴(kuò)散介質(zhì)，接收室中加入約6mL，液面恰與皮膚內(nèi)層接觸。實(shí)驗(yàn)開始后分別于1、2、4、6、8、12、24h取樣3mL，同時(shí)補(bǔ)加等量新鮮擴(kuò)散介質(zhì)。接收液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液于液相自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中，樣品按“1.2.3”HPLC色譜條件測(cè)定擴(kuò)散液中吳茱萸堿含量，單位面積(cm2)累積滲透量計(jì)算公式：

其中A為有效擴(kuò)散面積，V為接受液總體積，Cn為第n次取樣時(shí)接受液中藥物質(zhì)量濃度，Ci為第i次取樣時(shí)接受液中藥物質(zhì)量濃度，Vi為取樣體積。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩種貼劑吳茱萸堿含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 專屬性考察 陰性對(duì)照溶液的制備：取空白貼劑1片，按照供試品溶液制備方法制備，作為陰性對(duì)照溶液。 取供試對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各10μL，分別進(jìn)樣。結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液對(duì)吳茱萸堿色譜峰無干擾，方法專屬性良好。詳見圖1。

圖1 吳茱萸堿對(duì)照品、浸膏、貼劑及空白貼HPLC色譜

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取已配制的對(duì)照品母液1mL，用甲醇定容至50mL容量瓶中，取1.5mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾至液相自動(dòng)進(jìn)樣小瓶，設(shè)定進(jìn)樣體積為10μL、12μL、14μL、16μL、18μL、20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=134 070.86X-30 957.86，r=0.999 5。結(jié)果表明，吳茱萸堿進(jìn)樣量在1.264～2.528μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取已配制的吳茱萸堿對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積,結(jié)果顯示：RSD為0.30%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取加酸吳茱萸貼1片，按照“1.2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備溶液1份，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定吳茱萸堿峰面積，其測(cè)定結(jié)果：RSD為1.95%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“1.2.3”項(xiàng)方法平行溶解6份貼劑膏體，分別測(cè)吳茱萸堿的含量，結(jié)果顯示：RSD值為1.12%，表明其中吳茱萸堿含量均勻，重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 量取吳茱萸堿含量已知的貼劑膏體溶液共6份(體積5mL)，按樣品吳茱萸堿含量的100%精密加入對(duì)照品，用甲醇定容至10mL容量瓶。依次測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示：平均回收率為98.75%，RSD為1.68%(n=6)。

2.1.7 含量測(cè)定結(jié)果 取“1.2.3”項(xiàng)已配制的供試品溶

液, 精密吸取20μL進(jìn)樣測(cè)定,平行進(jìn)樣3次，記錄峰面積，計(jì)算吳茱萸堿含量并求平均值。結(jié)果顯示：加酸貼吳茱萸堿含量為1.01mg/帖,未加酸貼吳茱萸堿含量為0.93mg/貼。

2.2 吳茱萸經(jīng)皮給藥貼劑的體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以藥物Qn為縱坐標(biāo)，對(duì)取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性回歸，見圖2。提示吳茱萸堿單位面積累積透皮量與時(shí)間呈良好線性關(guān)系，具有良好的體外透皮釋放性能。

結(jié)果表明吳茱萸加酸、不加酸貼劑吳茱萸堿24h累計(jì)透過率分別為7.89%、6.08%，且累計(jì)透皮率比較情況為：加酸貼(7.89%)>不加酸貼(6.08%)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明吳茱萸透皮貼劑的釋放行為比較符合零級(jí)方程, 提示藥物釋放為濃度梯度作用藥物的單純擴(kuò)散。結(jié)果見表1。

圖2 吳茱萸加酸帖、不加酸貼吳茱萸堿體外經(jīng)皮吸收曲線

吳茱萸貼24h累計(jì)透過量(μg·cm?2)24h內(nèi)累計(jì)透皮率(%)透皮速率(μg·cm?2·h?1)Q-t方程加酸4．207．890．18Y=0．5948X-0．2981r=0．9881不加酸2．996．080．13Y=0．4405X-0．1646r=0．9970

3 討論

因醋調(diào)吳茱萸粉末直接敷涌泉穴使用不方便，且不便于貯存和攜帶，故本文將其制作為貼劑，方便攜帶和貯存。實(shí)驗(yàn)考察了提取液直接加入醋酸提取，但提取方法過濾較為困難，因此改為提取浸膏中加入醋酸，再制備貼劑。

文獻(xiàn)[5]報(bào)道吳茱萸堿鹽酸鹽對(duì)小鼠有鎮(zhèn)靜催眠作用，因此本文以吳茱萸堿含量為檢測(cè)指標(biāo)。

采用浸膏方法制備吳茱萸貼劑是可行的，且其中加酸貼吳茱萸堿具有良好的體外透皮釋放性能。原因可能為加酸后吳茱萸堿轉(zhuǎn)化為吳茱萸堿鹽，帶正電荷，使藥物易于透過皮膚[6]，具體原因還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。兩種貼劑的累計(jì)透過率均較低，其原因有待研究。

[1] 張紅梅，趙志禮.吳茱萸的本草考證[J].中藥材,2011,34(2):307-309.

[2] 孫玉芝.吳茱萸貼敷涌泉穴臨床應(yīng)用概述[J].中醫(yī)外治雜志,2009,18(2):53-54.

[3] 徐勝東,賀曉慧.醋調(diào)吳茱萸敷貼涌泉穴輔助治療心因性失眠癥60例療效觀察[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(4):544-545.

[4] 王森,雷小娟.醋調(diào)敷吳茱萸粉末的體外透皮吸收考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(10):31-34.

[5] 崔曉秋.吳茱萸化學(xué)成分研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[6] 馬慶宴,秦潔.皮膚的生理特點(diǎn)與透皮吸收[J].生物學(xué)通報(bào)，1997,32(10):24-26.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Preparation and Evaluationin Virtoof Evodiamine Which Modulated by Vinegar Patches

Du Nuan, Zhang Shiyu, Mao Yafeng*

(Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)

Objective:To prepare evodiamine transdermal patches and study the effects of adding acid or unevodiamine transdermal patches for percutaneous permeability in virto by HPLC.Methods:Evodiamine transdermal patches are prepared using PVP as main excipients, make the abdomen skin of SD rats as transdermal barrier,expolit TK-20B for content determination by HPLC, and compare two kinds of transdermal patches finally.Results:Prepared evodiamine transdermal patches successfully and percutaneous permeability of transdermal patches by adding acid are better.Conclusion:Suggested the possiblility of preparing the extract of evodiamine to obatin patches,and evodiamine transdermal patches show good percutaneous permeability in virto .

Evodiamine;Transdermal Patches; Transdermal Rate.

2014-07-04

都暖(1989-)，女，天津中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。

張師愚(1962-)，男，天津中醫(yī)藥大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。

R283.6

A

1673-2197(2014)20-0016-03