姜 莉，周寶龍，楊 燁，葉群梁，劉學(xué)波，王玉堂

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司 陜西 洋縣 723300)

黑米酒以黑米為主要原料，通過傳統(tǒng)的發(fā)酵和勾兌工藝制成，由于其具有獨特的香氣和風(fēng)味以及較低的酒精度，受到越來越多消費的青睞[1-2]。黑米中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)，組成齊全的氨基酸以及多種微量元素（Se、Zn、Fe、Mn、Ge等）和維生素等營養(yǎng)成分[3]。此外黑米中還含有能調(diào)節(jié)人體多種生理功能的酚類成分（如花色苷、黃酮以及酚酸類物質(zhì)等），這些成分具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[4-5]。黑米作為一種天然保健食品，同時也是功能食品的理想原料[6-7]。近年來，不少地方出現(xiàn)以黑米、紅米等為主要原料的釀酒企業(yè)，這對黑米的開發(fā)和深加工有著積極深遠的意義。目前，關(guān)于黑米酒中酚類活性物質(zhì)的種類和含量的研究未見報道，建立準確的定量方法對研究黑米酒的保健功能以及質(zhì)量控制具有重要意義。酚酸類化合物分析的方法有紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜[8-11]、毛細管電泳和膠束毛細管電動色譜等。由于高效液相色譜具有多種組分同時測定，結(jié)果準確可靠等特點，廣泛用于食品中黃酮、酚酸類物質(zhì)的檢測。如李永庫等[12]對葡萄酒、方玲玲等[13]對櫻桃酒、劉群濤等[14]對啤酒、胡華等[15]對醬油、孫崇臻等[16]對蜂蜜中的多種酚酸及黃酮類物質(zhì)進行測定，建立了可靠的分析方法。本實驗采用高效液相色譜法-二級管陣列檢測（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）法，建立了黑米酒中8種酚酸（沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸和阿魏酸）和3種黃酮類物質(zhì)（蘆丁、異槲皮苷和槲皮素）同時測定的方法，并用于同類米酒的測定。該方法靈敏度高，結(jié)果準確可靠，為研究米酒的功能成分及其質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米酒：陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司；紅米酒：井岡山市絹花紅米酒廠；黃酒：紹興白塔釀酒有限公司。

沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素標(biāo)品購于上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈、冰乙酸和乙酸乙酯購于美國天地公司。水為蒸餾水和超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-M20A檢測器，SIL-20A自動進樣器及CLASS-VP工作站）：日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；生化儀器KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器公司；PHS-3C酸度計：上海雷磁精科儀器廠；萬分之一天平：梅特勒-托利公司。

1.3 色譜條件

色譜柱C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為100%超純水水（含1%乙酸），B 為50%乙腈溶液（含1%乙酸）。低壓梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速1mL/min。沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測波長260nm，咖啡酸、香豆酸和阿魏酸檢測波長320nm，柱溫30℃，進樣量為20μL。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理[17-18]

取一定樣品，用濃鹽酸調(diào)至pH=2.0，然后準確吸取樣品10mL于125mL分液漏斗中，加入20mL 水，再加入30mL乙酸乙酯，振搖1min，靜置10min，待分層完全后將下層液再次進行萃取，合并乙酸乙酯層。40℃條件下減壓濃縮至干。殘渣用2mL20%乙腈溶解，0.45μm濾膜過濾，上機測定。

1.4.2 標(biāo)準溶液的配制

分別精確稱取各標(biāo)準品5.0mg，用甲醇溶解定容至10mL，得到每個標(biāo)準品的貯備溶液500mg/L，置于4℃冰箱中避光保存。分別移取1mL 各單個標(biāo)準貯備溶液混合，用20%乙腈溶液定容至50mL 得到質(zhì)量濃度為10mg/L混合標(biāo)準品使用液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

將11種500mg/L的標(biāo)準儲備液稀釋后進行進行全波長光譜掃描，各待測的最大吸收波長見表2。實驗確定，定量測定沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測波長為260nm，咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸檢測波長為320nm。

2.1.2 流動相的選擇[19]

以C18色譜柱為固定相時，常用的流動相有甲醇-水、乙腈-水等[20]。但是由于酚羥基、羧基在水溶液中發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。加入少量酸性試劑，可抑制酚類物質(zhì)的電離，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，有利于增強在固定相上的保留，提高分離度，避免色譜峰拖尾。分別對水-甲醇體系，水-乙腈體系作為流動相進行比較，實驗最終選擇水為A相，50%乙腈為B相，二者均含有1%乙酸，在此條件下，梯度洗脫時，基線發(fā)生較小的飄移，并獲得較好的分離效果。

2.1.3 梯度洗脫條件

由于酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似，要實現(xiàn)11種酚類物質(zhì)的同時檢測，需采用梯度洗脫的方式改善分離度。實驗對洗脫梯度進行優(yōu)化，確定洗脫程序。洗脫程序見表1。在此梯度洗脫條件下，11種酚類物質(zhì)達到很好的色譜分離，標(biāo)樣色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Elution program of mobile phase

圖1 11種酚酸標(biāo)準品色譜圖(260nm、320 nm)Fig.1 Chromatograms of 11 phenolic acid standards at 260nm and 320nm

2.2 標(biāo)準曲線的建立

分別取儲備液適量，用甲醇配制0.5mg/L、1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10mg/L的混合標(biāo)準溶液，在確定的色譜條件下進樣分析，平行測定3次，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。結(jié)果表明，11種酚類物質(zhì)在質(zhì)量濃度為0.5～10.0mg/L范圍內(nèi)的線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.996，結(jié)果見表2。

表2 11種酚類物質(zhì)的標(biāo)準曲線與相關(guān)系數(shù)Table 2 Standard curves and correlation coefficients of eleven phenolic substances

2.3 精密度實驗

為考察方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對加標(biāo)樣品進行重復(fù)6次測定，以各組分色譜峰峰面積的計算其相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3，RSD為1.3%～3.3%，由此可見，該方法穩(wěn)定性和精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收率實驗

表3 方法的精密度和黑米酒加標(biāo)回收率(n=6)Table 3 Precision and recovery of standard addition of black rice wine

為考察方法的準確度，實驗準確吸取黑米酒10mL，加入2mL 10mg/L的混合標(biāo)準液，混勻后按照樣品處理的方法進行處理，在上述色譜條件下測定，重復(fù)3次，測得回收率結(jié)果見表3。11種酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率為83.5%～105.1%。

2.5 樣品測定

根據(jù)前述的樣品提取條件和色譜條件，對黑米酒中的酚類物質(zhì)進行測定。黑米酒提取液色譜圖見圖2。實驗同時對其他米酒產(chǎn)品的多酚類物質(zhì)進行分析測定。結(jié)果見表4。由此可見，不同米酒中的酚類物質(zhì)含量差別較大，黑米酒中11種組分均有檢出，其中原兒茶酸含量最高，為7.612mg/L，咖啡酸含量較高，異槲皮苷、蘆丁也明顯高于其他2種米酒。紅米酒、糯米酒中對羥基苯甲酸、咖啡酸相對含量較高。

圖2 黑米酒中酚酸色譜圖(260nm、320nm)Fig.2 Chromatograms of black rice wine at 260nm and 320nm

表4 幾種米酒中黃酮和酚酸類物質(zhì)的測定結(jié)果Table 4 Contents of flavonoids and phenolic acids in rice wine

3 討論與結(jié)論

3.1 建立了可用于黑米酒中酚類化合物分析的高效液相色譜方法。采用50%乙腈-超純水（含1%乙酸）為流動相，低壓梯度洗脫，11種酚類物質(zhì)在45min內(nèi)得到了較好分離?；厥章试?3.5%～105.1%，相對標(biāo)準偏差為1.3%～3.3%。表明該方法準確可靠，可用于米酒中酚類物質(zhì)測定。

3.2 通過對采用不同原料釀造米酒中的酚類物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，米酒中酚類物質(zhì)的含量和種類與原料來源密切相關(guān)，這為米酒類產(chǎn)品的開發(fā)及其保健功能的研究提供依據(jù)。

3.3 實驗過程中標(biāo)準物質(zhì)種類有限，尚有多種酚類物質(zhì)未能確定，將進一步結(jié)合質(zhì)譜進行判斷。

[1]SHEN F,NIU X Y,YANG D T,et al.Determination of amino acids in Chinese rice wine by fourier transform near-infrared spectroscopy[J].J Agr Food Chem,2010,58(17):9809-9816.

[2]XU C L,RUO L H,FANG C,et al.Bacterial community dynamics during the traditional brewing ofWuyiHong Qu glutinous rice wine as determined by culture-independent methods[J].Food Control,2013,34(2):300-306.

[3]游月華.紫黑米的色素和營養(yǎng)成分研究綜述[J].中國稻米，2006（5）：7-8.

[4]陳世平，鄒鎖柱，吳惠芳，等.黑米黃酒工藝及產(chǎn)品穩(wěn)定性研究[J].釀酒科技，2006，141（3）：75-77.

[5]REVILLA E,RYAN M.Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high-performance liquid chromatography photodiode array detection without sample preparation[J].J ChromatographyA,2000,881(1-2):461-469.

[6]劉達玉，馬艷華，王新惠，等.黑米酒的釀造及其品質(zhì)分析研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（9）：86-90.

[7]陳祈磊，夏兵兵，丁琦峰，等.紅米/大米半固態(tài)釀制米酒的比較研究[J].成都大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，30（3）：209-211.

[8]JAKOBEK L,SERUGA M,VOCA S,et al.Flavonol and phenolic acid composition of sweet cherries(cv.Lapins)produced on six different vegetative rootstocks[J].Sci Hortic-Amsterdam,2009,123(1):23-28.

[9]康俊杰，李 艷.HPLC 檢測葡萄酒中有效成分的研究進展[J].釀酒科技，2009，183（9）：112-115.

[10]VICHAPONG J,SOOKSERM M,SRIJESDARUK V,et al.High performance liquid chromatographic analysis of phenolic compounds and their antioxidant activities in rice varieties[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(9):1325-1330.

[11]王祥軍，齊軍倉，賈力群，等.反相高效液相色譜法快速測定大麥子籽粒中13 種酚酸類化合物[J].分析試驗室，2011，30（11）：5-10.

[12]李永庫，李曉靜，歐小輝.固相萃取-高效液相色譜法同時測定葡萄酒中沒食子酸等8 種多酚類化合物[J].食品科學(xué)，2008，29（4）：283-286.

[13]方玲玲，肖作兵，牛云蔚，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定櫻桃酒中的5 中酚酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）：172-176.

[14]劉群濤，李 崎，武千鈞，等.反相高效液相色譜法測定啤酒中的酚酸[J].分析實驗室，2006，25（12）：68-70.

[15]胡 華，張惟廣，肖昭競，等.HPLC 法測定醬油中的8 種酚酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（8）：122-125.

[16]孫崇臻，王 超，蔡子哲，等.高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸[J].食品科學(xué)，2013，34（10）：281-285.

[17]成宇峰，張振文.HPLC 測定葡萄酒中單體酚樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化[J].釀酒科技，2008，164（2）：116-118.

[18]YAO L H,DATTA N,TOM?S-BARBER?N F A,et al.Flavonoids,phenolic acids and abscisic acid in Australian and New ZealandLeptospermumhoneys[J].Food Chem,2003,81(2):159-168.

[19]謝 越，俞 浩，汪建飛，等.高效液相色譜法同時測定滁菊樣品中的九種酚酸[J].分析化學(xué)，2013，41（3）：383-388.

[20]吳燕華，劉文力，閻 紅，等.高效液相色譜法測定蘋果中的酚類物質(zhì)[J].分析化學(xué)，2002，30（7）：826-828.