曹樂民，周志強，崔俊林，石明生*

（1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 鄭州 451450；2.重慶三峽職業(yè)學院，重慶 404001）

山楂葉為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.var.maior N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉。藥理及臨床試驗表明，山楂葉中黃酮類化合物具有降血壓、調(diào)血脂、增加冠脈流量、改善心肌供血供氧等作用，對高血壓、高血脂、冠心病及心絞痛等心血管疾病均具有良好療效。山楂葉總黃酮在應用及含量測定時常用的方法有水提法和乙醇溶液提取法2種，本試驗考察了山楂葉的采摘時節(jié)、溫度、pH值、料液比、提取時間等因素對山楂葉中總黃酮提取率的影響，得出了水提法最優(yōu)的提取工藝，為山楂葉中黃酮類物質(zhì)的提取和使用提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的蘆?。何靼踩谏锟萍加邢薰举徺I；山楂葉（A采果后9月下旬綠葉；B落葉前綠葉；C落葉）：太行山上采摘；氫氧化鈉NaOH（分析純）、亞硝酸鈉Al（NO）3（分析純）、硝酸鋁Al（NO）3（分析純）：成都科龍化工試劑廠；蒸餾水：pH 7.0～8.0。

1.2 儀器與設備

HH-4型數(shù)顯水浴鍋：金壇市杰瑞爾電氣有限公司；圓底燒瓶、容量瓶、稱量瓶、移液管：北京匯?？苾x科技有限公司；DHG-9053A型恒溫鼓風干燥箱：上海合恒儀器設備有限公司；7200型分光光度計：上海尼龍柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制定

稱取20.8mg蘆丁，用體積分數(shù)60%的乙醇溶解并稀釋至100mL，作為對照品溶液。精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%NaNO2溶液1mL，使混勻放置6min，然后用1mL移液管移取10%的Al（NO）3溶液1mL，使混勻放置6min，然后用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻放置15min，并做空白對照。按分光光度法在波長500nm處測定吸光度值，所取標準溶液的濃度和吸光度值數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程：y=11.687 265x-0.008 186，R=0.999 719，結(jié)果表明，蘆丁濃度為0.008 3～0.049 92mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 提取

試探試驗：經(jīng)初步試驗得出浸提液在稀釋50倍時，其吸光度值在標準曲線的吸光度值范圍之內(nèi)。

優(yōu)化試驗依次對樣品A、樣品B、樣品C進行浸提。

提取步驟：

水體和底層溶氧低、水體易分層、水體交換能力差：①多開增氧機和爬水機，滾動和震動水體，促進水體上下層交換，防止溶氧、水溫分層，工作基本點必須圍繞溶氧。增氧機并不產(chǎn)氧，而是起到活絡水體和輸送氧的作用，70%以上的溶氧是依靠藻類光合作用生產(chǎn)提供的，可見適時適量培藻，保持藻類新陳代謝非常重要。②水質(zhì)好壞決定溶氧高低。藻相的好壞決定了水色，水色的好壞可以判斷溶氧的高低，所以冬棚養(yǎng)殖一定要養(yǎng)護好水質(zhì)，才能保證溶氧充足。需對水質(zhì)不定期的修復和保養(yǎng)，千萬不要等到水質(zhì)變壞了才去調(diào)改，既費成本又很難調(diào)。

干燥山楂葉→除雜→破碎→浸提→過濾→濾液→測定。

具體操作：

①稱樣：每次稱取樣品10.00g置于圓底燒瓶中，共16組，每組2個樣品；②加堿液：按表1和表2要求向圓底燒瓶中加0.5%NaOH溶液；③加水：按表1和表2要求向1號～16號的燒瓶中加蒸餾水；④浸提：準備8臺水浴鍋，設定溫度。待水溫達到指定溫度后放置樣品，每2個平行樣品放置在水浴鍋的對角位置；⑤計時：按表1和表2要求給1號～16號的樣品計時；⑥過濾：提取結(jié)束后過濾，靜置冷卻至常溫且無沉淀。

1.3.3 樣品測定

用1mL移液管取靜置冷卻后的濾液1mL至250mL容量瓶中，再用5mL移液管移取5mL蒸餾水進行稀釋，用1mL移液管移取5%的NaNO2溶液1mL，混勻后放置6min，用1mL移液管移取10%的Al（NO）3溶液1mL，混勻后放置6min，用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻后放置15min。移取上清液1mL至50mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋定容，然后進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗因素水平及正交試驗設計

采用標準曲線法測定樣品濾液黃酮含量。對樣品A、樣品B、樣品C分別測定。正交試驗因素及水平見表1。

表1 山楂葉中總黃酮浸提工藝優(yōu)化正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from hawthorn leaves

2.2 樣品提取結(jié)果與分析

2.2.1 樣品A最佳提取條件的確定

由表2可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序為浸提溫度、浸提時間、料液比、pH值，并得出樣品A在浸提溫度90℃，浸提時間3h或4h，料液比1∶25，pH值為8.5時提取率最高，被確定為最優(yōu)組合，考慮提取成本，提取時間最終確定為3h，即最優(yōu)組合為A4B3C4D3。

2.2.2 樣品B最佳提取條件的確定

對樣品B進行測定，試驗結(jié)果如表3所示。

表2 樣A提取條件正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample A

表3 樣B提取條件正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample B

由表3可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序為料液比、浸提溫度、浸提時間、pH值，并確定樣品B在浸提溫度90℃，料液比1∶20，浸提時間3h或4h，pH值8.5時樣品的吸光度值最大，即提取液中黃酮類物質(zhì)含量更高?？紤]提取成本，提取時間最終確定為3h，即最優(yōu)組合為A3B3C4D3。從表3中樣品的吸光度值經(jīng)計算得出，樣品B較樣品A中黃酮含量高。

2.2.3 樣品C最佳提取條件的確定

對樣品C進行測定，試驗結(jié)果如表4所示。

表4 樣C提取條件正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for optimization of extraction process of flavonoids from sample C

由表4可知，各因素對吸光度值影響程度的主次順序為提取溫度、料液比，提取時間、pH值，并確定樣品C在浸提溫度90℃，料液比為1∶20，浸提時間為3h或4h，pH值為8.0或8.5時樣品的吸光度值最大，即黃酮類物質(zhì)提取率最高。

2.3 采樣時期對黃酮提取率的影響

試驗結(jié)果得出，樣品B中的黃酮類提取率最高，其次是樣品A，最后是樣品C。即不同的采樣時期對黃酮的提取率有較大的影響。因此，建議采集山楂葉的時期在山楂收獲前，采摘還沒有脫落的葉子來進行黃酮的提取。從黃酮溶液的口感及提取效率考慮，確定最優(yōu)組合為A3B3C4D3。

2.4 樣品B中黃酮物質(zhì)總含量

使用樣品B的最優(yōu)提取工藝對樣品B進行2次提取，最終確定樣品B中黃酮物質(zhì)測定如表5所示，2次黃酮物質(zhì)提取率分別為x1和x2。

表5 樣品B優(yōu)化工藝提取結(jié)果Table 5 Results and extraction result of optimization process from sample B

經(jīng)計算得出，每10g樣品B前后2次提取黃酮類物質(zhì)含量分別為x1=0.800 0g，x2=0.237 5g，故每10g山楂葉提取總黃酮含量為1.037 5g，山楂葉中總黃酮提取率為10.375%。

3 結(jié)論

經(jīng)以上3次試驗可知樣品A、樣品B、樣品C山楂葉樣品中，樣品B中黃酮含量最高，并通過正交試驗設計分析得出最優(yōu)浸提條件為A3B3C4D3，即山楂采摘前的山楂葉中總黃酮提取率最高，并得出最佳提取工藝為浸提溫度90℃，pH值8.5，料液比1∶20，浸提時間3h時，可將山楂葉中的黃酮類物質(zhì)有效提取。試驗得出山楂采摘前的山楂葉中總黃酮提取率為10.375%。

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