趙恒強，陳軍輝，耿巖玲，劉建華，王曉*

(1.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;2.國家海洋局第一海洋研究所，青島市現(xiàn)代分析技術(shù)及中藥標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，山東 青島 266061)

中藥是多成分多靶點的復(fù)雜體系，如何對中藥進行有效的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容［1］。海洋中藥是中草藥的重要組成部分，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對滯后，也缺乏進行質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)、有效的鑒別手段。因此，開展海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別研究，對加快開發(fā)海洋中藥資源具有重要意義。

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)因能表征中藥的整體性得到普遍應(yīng)用［2－4］，但是指紋圖譜僅能表征中藥多種化學(xué)成分的差異情況，而不能確切反映中藥產(chǎn)品的藥效。如果將指紋圖譜與生物、化學(xué)活性結(jié)合起來，以反映中藥活性的成分為指標(biāo)用于中藥的質(zhì)量控制，將能更好地反映中藥的質(zhì)量。有關(guān)譜效結(jié)合指紋圖譜的研究目前已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制研究的熱點［1，5］。

抗氧化活性是中藥研究的熱點之一［6］，近年來，采用抗氧化活性指紋圖譜對中藥進行質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的探索性研究報道屢見不鮮［7－13］。然而，以往的研究多是以基于穩(wěn)定自由基(如:DPPH、ABTS等)-HPLC聯(lián)用技術(shù)的抗氧化成分在線篩選方法對中藥提取物進行篩選，從而進一步建立其抗氧化活性指紋圖譜用于其質(zhì)量控制。但是，由于該技術(shù)篩選速度快，對緩慢抗氧化成分易造成假陰性結(jié)果，不能全面反應(yīng)中藥的活性成分信息?；诜€(wěn)定自由基-HPLC聯(lián)用技術(shù)的離線抗氧化成分篩選方法因反應(yīng)時間充分，可以更好地避免假陰性結(jié)果，并且方法準(zhǔn)確度、靈敏度較高，引起了研究者的廣泛關(guān)注［14－16］。采用該篩選方法獲得的抗氧化活性成分所對應(yīng)的色譜峰作為指紋圖譜特征峰能更加全面地反應(yīng)中藥的活性成分信息。目前，有關(guān)這方面的研究未見報道。

本研究以藥食兩用的海洋中藥馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus(A.Agassiz))為研究對象，發(fā)展了基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜方法，并初步用于對不同來源樣品的鑒別。研究結(jié)果為海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了新思路、新技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有四元泵，DAD檢測器，自動進樣器等(美國 Agilent公司);KQ-400KDE型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);A J100型電子天平(瑞士 Mettler-Toledo公司)。AlltimaTMC18色譜柱(4.6×250mm，5 μm，美國Alltech公司)。

甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，DPPH(95%，德國Sigma-Aldrich公司)，蘆丁(95%，德國Sigma-Aldrich公司)，咖啡酸 (99%，德國Sigma-Aldrich公司)，實驗用水為超純水(電阻率為18mΩ·cm，Milli-Q公司)。

本文采用的10個不同批次馬糞海膽樣品分別采自青島、煙臺和大連沿岸海域，采集時間為2012年8月～9月，經(jīng)山東省科學(xué)院王曉研究員鑒定，均為馬糞海膽，樣品詳細信息見表1。海膽樣品經(jīng)自來水沖洗干凈后，置于烘箱中55℃鼓風(fēng)干燥至干。干燥后的海膽樣品避光、密閉、常溫貯藏。

表1 馬糞海膽樣品來源Table 1 Origins of Hemicentrotus pulcherrimus samples

1.2 溶液的配制

1.2.1 DPPH 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并配成0.1 mol/L的DPPH甲醇溶液，錫紙包裹嚴(yán)密，置冰箱中于4℃保存，使用時以甲醇稀釋至適當(dāng)濃度。

1.2.2 馬糞海膽樣品溶液的制備

精密稱取馬糞海膽樣品0.5 g，轉(zhuǎn)入25 mL具塞三角燒瓶中，加入25 mL超純水，超聲輔助提取25 min，提取溫度為室溫，將提取液過濾，并在55℃條件下進行旋蒸至干，用水溶解并定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，待用。

1.3 色譜條件

AlltimaTMC18色譜柱。流動相:A 20mmol/L HCOONH4+0.1%HCOOH水溶液;B 甲醇。流速:0.8mL/min。檢測波長:254 nm。溫度:室溫(20 ℃)。進樣量 20 μL。洗脫程序:0～10min，0%B;10～20min，0～5%B;20～35 min，5% ～10%B;35～45 min，10% ～40%B;45 ～55 min，40% ～100%B;55 ～70min，100%B。

1.4 抗氧化成分的篩選

取馬糞海膽水提液0.5 mL置于棕色瓶中，加入0.5 mL DPPH溶液迅速混合均勻，避光反應(yīng)20min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后采用HPLC進樣測定，進樣量為40 μL。以同體積的甲醇代替DPPH溶液作為空白對照，對比色譜峰面積變化情況，其中色譜峰面積明顯減小的成分為潛在的抗氧化劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

初步研究表明，馬糞海膽的水提物具有較好的自由基清除活性，考察了4根不同的反相色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 ×250mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 × 250mm，5 μm)，AlltimaTMC18色譜柱(4.6 × 250 mm，5 μm)，WatersXBridgeTMC18(2.1 ×150mm，3.5 μm)對馬糞海膽水提物的分離效果。發(fā)現(xiàn)采用AlltimaTMC18色譜柱時，馬糞海膽水提物中各色譜峰分離度較高，因此選擇AlltimaTMC18色譜柱用于馬糞海膽水提物分離研究。對比了采用甲醇－水和乙腈－水作為流動相時的分離效果，表明采用甲醇－水作為流動相時馬糞海膽水提物中各化合物具有良好的保留和分離效果。由于馬糞海膽水提物成分復(fù)雜，因此本研究采用梯度洗脫用于其分離研究。改變流動相酸度可以減少拖尾現(xiàn)象，考察了不同類型弱酸及含量(0.1%HCOOH，0.2%HCOOH，0.1%CH3COOH，0.2%CH3COOH)的影響，發(fā)現(xiàn)采用流動相 A 中加入0.1%HCOOH時，各峰對稱性較好。考察了流動相中添加不同類型緩沖鹽及濃度的影響，表明流動相A中加入20mmol/L HCOONH4時，各峰形尖銳，對稱性較好。因為在不同的檢測波長下，其提取物各色譜峰數(shù)量、峰高及分布均有明顯不同，所以考察了馬糞海膽水提物在不同波長(190～900 nm)下的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在254 nm時，其HPLC色譜圖色譜峰較多、且強度較高，因此本研究選擇254 nm用于HPLC分析的檢測波長見圖1。

圖1 馬糞海膽水提物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of the water extract of Hemicentrotus pulcherrimus

2.2 抗氧化成分的DPPH-HPLC篩選

用1.2.2方法制備的馬糞海膽樣品溶液采用1.3色譜條件進行分析，按照1.4所述篩選條件對馬糞海膽水提液中的抗氧化成分進行了篩選，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，采用本文的方法，在馬糞海膽的水提物中篩選到了9種成分，且在反相柱上的出峰時間較短，證明其極性較大。

2.3 方法學(xué)考察

首先，對反應(yīng)前后馬糞海膽基質(zhì)中添加的標(biāo)準(zhǔn)對照品咖啡酸、蘆丁的峰面積變化進行了考查。反應(yīng)后標(biāo)準(zhǔn)對照品咖啡酸、蘆丁的峰面積分別減小為反應(yīng)前的21.19%和 39.43%，3次測定 RSD 分別為 5.82%，7.43%，說明該篩選方法準(zhǔn)確性較高。

其次，在優(yōu)化的色譜條件下，以各抗氧化成分的色譜峰面積為考察指標(biāo)，對HPLC分析方法學(xué)分別進行了考察。同一馬糞海膽樣品6次平行進樣分析表明，各抗氧化成分峰面積的RSD值均低于3.35%，說明該方法具有較好的精密度;同一馬糞海膽樣品平行稱取6份，并依次按本研究方法進行處理、分析，各抗氧化成分峰面積的RSD值在5.43%范圍內(nèi)，說明該方法具有較好的重復(fù)性;將同一樣品分別在0、2、4、6、8、12 h進樣分析，各抗氧化成分峰面積的RSD值在3.31% ～5.62%(n=6)范圍內(nèi)，說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

由此可以看出，采用基于各抗氧化成分的HPLC分析方法，具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，為指紋圖譜的建立提供了方法基礎(chǔ)。

圖2 馬糞海膽水提物與DPPH反應(yīng)前后的色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatograms ofwater extractof Hemicentrotus pulcherrimus before and after reaction with DPPH free radicals

2.4 抗氧化活性指紋圖譜的建立

為進一步考察基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性成分對海洋中藥進行真?zhèn)舞b別的可行性，本研究將指紋圖譜與抗氧化活性結(jié)合起來形成基于抗氧化活性成分的指紋圖譜方法對海洋中藥進行真?zhèn)舞b別。

圖3 馬糞海膽抗氧化活性指紋圖譜Fig.3 Antioxidant fingerprint of Hemicentrotus pulcherrimus

本研究以馬糞海膽水提物中篩選到的9種抗氧化成分作為共有峰用于其指紋圖譜研究。為提高樣品間的可比性，降低色譜峰峰位變化的波動給保留值帶來的偏移，我們將色譜圖轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定而易于比較的數(shù)據(jù)表，實現(xiàn)圖譜的數(shù)據(jù)化，再以各抗氧化成分的峰號為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰的峰面積為縱坐標(biāo)，做成柱狀條形碼圖，更直觀地表現(xiàn)海洋藥用生物中各抗氧化成分的分布特征。本研究對在青島沿岸采集的8批馬糞海膽樣品，以各抗氧化成分的EIC峰面積為指標(biāo)，建立了基于其抗氧化活性成分的指紋圖譜(見圖3)。從圖中可以看出，各批次馬糞海膽樣品水提物中抗氧化成分含量分布存在相似的特征，能夠表現(xiàn)出馬糞海膽樣品的共有屬性。

2.5 不同來源樣品的相似度評價

本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A)計算青島沿岸采集的8批馬糞海膽和分別產(chǎn)自大連、煙臺的馬糞海膽樣品的相似度，結(jié)果見表2。

表2 10批樣品的相似度Table 2 Similarity analysis of 10 sets of samples

從表2可以看出，采用本文建立的基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化成分的指紋圖譜對不同批次、不同來源的馬糞海膽樣品的相似度計算表明:8批采自青島沿岸的馬糞海膽樣品具有較好的相似度，相似度均在0.90以上;而產(chǎn)自大連和煙臺的兩批馬糞海膽樣品的相似度較低，分別為0.78和0.84。說明本研究的基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜結(jié)合相似度分析，可以初步用于對不同來源的馬糞海膽樣品的正確區(qū)分。

3 結(jié)論

本研究初步探索了采用基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜對馬糞海膽樣品進行鑒別的可行性。結(jié)果表明，該方法結(jié)合相似度分析，可以實現(xiàn)對不同來源的馬糞海膽樣品的正確區(qū)分。本研究在一定程度上彌補了HPLC化學(xué)指紋圖譜技術(shù)缺乏藥效指標(biāo)成分的不足，提高了指紋圖譜的準(zhǔn)確性和特征性，為海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別研究提供了新方法、新思路。

［1］戚進，余伯陽.中藥質(zhì)量評價新模式——“譜效整合指紋譜”研究進展［J］.中國天然藥物，2010，8(3):171－176.

［2］蔡寶昌，潘揚，殷武.指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用［J］.世界科學(xué)技術(shù)，2000，2(5):9－14.

［3］陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究思路探討［J］.中國中藥雜志，2009，34(18):2410－2413.

［4］韋娟.化學(xué)成分指紋圖譜在中藥材質(zhì)量控制中的研究概況［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(13):194－195.

［5］李云飛，程翼宇，范驍輝.中藥多維譜效關(guān)系研究思路探討［J］.中國天然藥物，2010，8(3):167－170.

［6］李秋紅，李廷利，黃莉莉，等.中藥抗氧化的作用機理及評價方法研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，l 9(5):1257－1258.

［7］傅博強.甘草中有效成分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性測定及活性指紋圖譜研究［D］.廈門:廈門大學(xué)，2005.

［8］DING X P，QI J，CHANG Y X，et al.Quality control of feavonoids in Ginkgo biloba leaves by high-performance liquid chromatography with diode array detection and on-line radical scavenging activity detection［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(11):2204 －2210.

［9］DING X P，WANG X T，CHEN LL，et al.Quality and antioxidant activity detection of Crataegus leaves using on-line highperformance liquid chromatography with diode array detector coupled to chemiluminescence detection［J］.Food Chemistry，2010，120(3)，929–933.

［10］丁曉萍.基于抗氧化活性的生物活性和化學(xué)相關(guān)指紋的構(gòu)建及其在中藥質(zhì)量評價研究中的應(yīng)用［D］.南京:中國藥科大學(xué)，2009.

［11］CHANG Y X，DING X P，QI J，et al.Determination of phenolic acids in Danshen preparations by LC with chemiluminescence detection［J］.Chromatographia，2009，69(3):319–323.

［12］CHANG YX，DING X P，QI J，et al.The antioxidant-activity-integrated fingerprint:an advantageous tool for the evaluation of quality of herbal medicines［J］.Journal of Chromatography A，2008，1208(1):76 －82.

［13］CHANG Y X，YAN D M，CHEN L L，et al.Potency fingerprint of herbal products Danshen injection for their quality evaluation［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2009，57(6):586－590.

［14］SHUI G H，PENG L L.An improved method for the analysis of major antioxidants of Hibiscus esculentus Linn［J］.Journal of Chromatography A，2004，1048(1):17－24.

［15］SHUI G H，LEONG L P，WONG S P.Rapid screening and characterization of antioxidants of Cosmos caudatus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2005，827(1):127 －138.

［16］TANG D，LI H J，CHEN J，et al.Rapid and simple method for screening of natural antioxidants from Chinese herb Flos Lonicerae Japonicae by DPPH-HPLC-DAD-TOF/MS［J］.Journal of Separation Science，2008，31(20):3519 －3526.