李春霞

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001)

蛭弧菌(Bdellovibrio)是一類寄生于其它細(xì)菌并導(dǎo)致其裂解的寄生性細(xì)菌［1］。蛭弧菌具有類似噬菌體的功能，對(duì)自然環(huán)境中的細(xì)菌具有很強(qiáng)的裂解作用，其與宿主間并沒有嚴(yán)格的特異性，有研究表明，蛭弧菌能裂解大多數(shù)科屬的革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌［2］，能對(duì)導(dǎo)致人類食物中毒和漁業(yè)養(yǎng)殖病害的致病菌具有良好的裂解清除效果，且對(duì)動(dòng)植物無毒副作用［3］。

響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology)是解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法，其首先進(jìn)行合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過實(shí)驗(yàn)得到相應(yīng)數(shù)據(jù)，運(yùn)用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的顯著分析來尋求最優(yōu)的條件參數(shù)［4］。應(yīng)用Design-Expert 軟件系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合曲線，建立數(shù)學(xué)模型，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性，利用三維立體圖形，觀察響應(yīng)曲面，尋求最佳組合條件［5］。

本文在研究影響蛭弧菌BD1 生長的pH、鹽度(NaCl)、二價(jià)金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，以pH值、鹽度、二價(jià)金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉為響應(yīng)因素，以菌體濃度的對(duì)數(shù)值為響應(yīng)值，用Design-Expert 6.0 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)建立響應(yīng)曲面模型，優(yōu)化蛭弧菌BD1 的生長條件。

1 材料和方法

菌種:蛭弧菌BD1、宿主菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存

培養(yǎng)基:DNB 雙層平板培養(yǎng)基等均按照參考文獻(xiàn)［6］配制。

1.1 宿主菌培養(yǎng)

宿主菌接種于滅菌的2216E 液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為200(r·min-1)，溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14～15 h，使其處于對(duì)數(shù)生長期。

1.2 蛭弧菌的培養(yǎng)

將懸浮好的蛭弧菌與宿主菌以體積比2∶5 均勻混合并靜置30 min，取0.7 mL 混合液與3.5 mL 50 ℃的DNB 上層培養(yǎng)基均勻混合并傾注于DNB下層平板中。將DNB 雙層平板倒置于溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)是最常用的響應(yīng)面分析法，適用于2～5 個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。采用該法能夠在有限的試驗(yàn)次數(shù)下，對(duì)因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還能對(duì)各因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響過程的最佳條件。根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)蛭弧菌的生長繁殖能力具有明顯影響的4 個(gè)因素，包括二價(jià)離子(Mg2+、Ca2+)(x1)、鹽度(x2)、谷氨酸鈉(x3)和pH(x4)，每個(gè)因素選取5 個(gè)水平，分別以-2，-1，0，1 和2 進(jìn)行編碼(見表1)，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表2)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，研究蛭弧菌的最佳培養(yǎng)條件，為蛭弧菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)中的變量及其水平

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

1.4 培養(yǎng)方法

取30 個(gè)150 mL 的三角瓶，每瓶中精確地分裝50 mL 新配置的DNB 液體培養(yǎng)基，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表2)調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH、鹽度、谷氨酸鈉和Ca2+、Mg2+濃度，高壓滅菌后待用。向每瓶培養(yǎng)基中添加蛭弧菌和宿主菌，使其濃度分別達(dá)到2 ×102PFU/mL 和2 ×1010CFU/mL。在恒溫?fù)u床中(250 r·min-1)培養(yǎng)24 h，采用DNB 雙層平板法檢測(cè)瓶中蛭弧菌的濃度。中心組合實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)以減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以響應(yīng)面分析法得到的BD1 的最佳生長條件，做3 次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果的相符性驗(yàn)證響應(yīng)面分析方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，經(jīng)Design Expert 6.0 軟件用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析擬合后得到如下二次回歸方程

模型的方差分析結(jié)果如表3所示，在置信度水平α=0.01 時(shí)，該回歸模型極顯著，方程確定系數(shù)R2=0.9949，失擬項(xiàng)不顯著，說明對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的擬合，代表性較好，進(jìn)而可用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)，變差系數(shù)CV=4.75%相對(duì)較低，說明整個(gè)試驗(yàn)具有良好的精密度和可靠性。

模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢測(cè)結(jié)果如表4所示，pH 對(duì)蛭弧菌生長活性有極顯著的影響(P＜0.0001)，谷氨酸鈉濃度、鹽度和二價(jià)金屬離子濃度則對(duì)蛭弧菌的生長繁殖能力具有顯著的影響(P＜0.05)。二次項(xiàng)(和)均極顯著，且交互項(xiàng)(x2x3和x3x4)顯著(P＜0.05)，說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不僅僅是簡單的線性關(guān)系，而是存在一定的交互作用，模型響應(yīng)面如圖1～圖6所示。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表

表4 二次多項(xiàng)模型中回歸系數(shù)的估計(jì)值

圖1 鹽度與Ca2+、Mg2+間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖2 谷氨酸鈉與Ca2+、Mg2+間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖3 pH 值與Ca2+、Mg2+濃度間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖4 谷氨酸鈉與鹽度間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖5 pH 與鹽度間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖6 pH 與谷氨酸鈉間交互作用對(duì)蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩個(gè)因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著［7］。從圖1～圖6 可以直觀地看出，鹽度和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉與鹽度交互作用不顯著;pH 與鹽度，pH 與谷氨酸鈉，pH 與二價(jià)金屬離子交互作用顯著。

模型優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)x1=-0.31，x2=-0.24，x3=-0.41，x4=0.38，即Ca2+、Mg2+濃度為6.38(mmol·L-1)，鹽度為2.88%，谷氨酸鈉濃度為4.18(mmol·L-1)，pH 為7.38 時(shí)，蛭弧菌的生長繁殖能力最強(qiáng)，此時(shí)模型預(yù)測(cè)蛭弧菌濃度對(duì)數(shù)值達(dá)到8.46。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕捎蒙鲜鰞?yōu)化條件培養(yǎng)蛭弧菌，考慮到實(shí)際操作的便利，將優(yōu)化條件修正為Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4，實(shí)際測(cè)得的蛭弧菌的濃度對(duì)數(shù)值為8.95，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為5.8%，因此通過該模型優(yōu)化得到的蛭弧菌BD1 的最佳培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的理論價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析方法，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了四因素五水平實(shí)驗(yàn)，采用Design-Expert 軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到了菌體生長模型，以及模型最優(yōu)時(shí)各因素的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:BD1 的最佳生長條件為:Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4。在該培養(yǎng)條件下，菌體生長模型達(dá)到顯著水平，模型可以對(duì)蛭弧菌BD1在不同條件下的生長情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為蛭弧菌的培養(yǎng)和應(yīng)用提供理論參考。

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