岳 崟，余詩婷，張繼文，孫宗毅，王麗梅，2 *，劉烈炬

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023）

魚油富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA），它們屬于ω-3系列的長鏈多不飽和脂肪酸，在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化效率較低，需要從食物中攝取，屬于必需脂肪酸。尤其是DHA，它是大腦中重要的脂肪酸，占大腦灰質(zhì)脂肪酸總量的12%～16%[1]，有研究顯示，它在維持視網(wǎng)膜以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮了重要的作用[2]。EPA能夠幫助降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，具有預(yù)防心腦血管疾病的作用。EPA對大腦認(rèn)知功能也有影響，近來有研究顯示，飲食中攝入充足的EPA，可以增加青壯年大腦的認(rèn)知功能[3]。有研究表明，飲食中添加一定劑量的魚油能夠改善阿爾茨海默病病人的癥狀，減緩認(rèn)知功能的下降，增強大腦學(xué)習(xí)記憶功能[4]。還有研究顯示，孕期乳牛飲食添加一定量的魚油能夠提高牛乳中DHA和EPA的含量[5]。

目前，DHA和EPA可用于食品添加劑，尤其在歐洲和日本，已被用于嬰幼兒配方奶粉和雞蛋中[6]，其應(yīng)用前景廣闊，并且全球?qū)胗變杭霸衅趮D女的營養(yǎng)也愈加關(guān)注。目前，已經(jīng)有大量研究顯示，孕期適當(dāng)補充DHA能提高早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[7]，有利于神經(jīng)組織的生長發(fā)育，提高嬰幼兒大腦認(rèn)知功能[8]；但是也有研究顯示，孕期補充DHA，不能提高幼兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[9]、認(rèn)知功能和語言能力[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，孕期補充魚油能夠增強嬰幼兒的大腦認(rèn)知功能，預(yù)防發(fā)育期兒童過敏癥的發(fā)生[11]。該研究以與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基1（N-methyl-D-aspartate receptor 1，NR1）、即刻早期基因中的c-fos、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）基因為切入點，觀察最適劑量的魚油對孕期母鼠以及新生大鼠海馬組織中三個基因mRNA表達量的影響，探究魚油影響認(rèn)知功能的可能機制，這不僅驗證了魚油對孕鼠及新生大鼠認(rèn)知能力的影響，也為進一步研究魚油影響大腦認(rèn)知功能的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級、成年sprague-dawley大鼠32只，體質(zhì)量（250±50）g：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供（動物許可證號SCXK2010-0009）。

魚油（純品）：湖北福星生物科技有限公司出品；羧甲基纖維素鈉：連云港友進食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限公司；總RNA提取試劑盒（TRIzolRReagent）：Invitrogen公司；一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（All-in-OneTM first-strand cDNA synthesis kit）、實時熒光定量PCR試劑盒（All-in-OneTMqPCR mix）：GeneCopoeiaTM公司；NR1、c-fos和CREB引物：Invitrogen公司設(shè)計合成；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DY89-Ⅰ型電動玻璃勻漿機：寧波新芝科器研究所；3K15型號高速冷凍離心機：德國Sigma公司；WH-1微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；TCRADIENT梯度PCR儀：德國Biometra公司；ABI7500PCR儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與喂養(yǎng)

64只成年SD大鼠，于標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境。然后使用隨機數(shù)字表法將其分為4組：陰性對照組、魚油低劑量組、魚油中劑量組和魚油高劑量組。每組8只雌鼠，8只雄鼠，分8籠喂養(yǎng)，每籠一雌一雄，每籠大鼠自由飲食進水（飼喂棒狀飼料）。每日清晨檢查雌鼠是否存在陰道栓，若有則記為懷孕，將成功受孕的雌鼠分籠飼喂，每日定時定量灌胃給魚油（只有受孕的雌鼠灌胃），連續(xù)灌胃60 d。魚油劑量參照學(xué)者PAN J P等[12-13]的研究，確定其灌胃劑量依大鼠體質(zhì)量確定，為低劑量150 mg/（kg·d）組、中劑量300 mg/（kg·d）組、高劑量600 mg/（kg·d）組，（每5 d稱質(zhì)量1次，調(diào)整劑量），陰性對照組灌胃相應(yīng)劑量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每組8只母鼠，連續(xù)飼養(yǎng)，檢測其海馬組織NR1、c-fos、CREBmRNA的表達。在灌胃60 d期間，雌鼠也完成生產(chǎn)，新生的大鼠不用灌胃魚油。將每組孕鼠所產(chǎn)大鼠按照它們對應(yīng)的母鼠分組（陰性對照組的孕鼠所產(chǎn)大鼠為新生大鼠的陰性對照組，低劑量組孕鼠所產(chǎn)大鼠為新生乳鼠的魚油低劑量組，中劑量組孕鼠所產(chǎn)大鼠為新生乳鼠的魚油中劑量組，高劑量組孕鼠所產(chǎn)大鼠為新生乳鼠的魚油高劑量組），每組隨機選擇8只新生乳鼠，檢測其海馬組織NR1、c-fos、CREBmRNA的表達。

1.3.2 實時熒光定量檢測母鼠及新生大鼠海馬組織NR1、c-fos、CREBmRNA的表達

實驗結(jié)束后的雌鼠，用20%烏拉坦（現(xiàn)配）麻醉，斷頭處死，新生乳鼠直接用剪刀斷頭處死，取雌鼠與新生乳鼠的頭部于冰盤上，迅速剝離海馬組織，并迅速分裝于相應(yīng)EP管中，加入1 ml TRIzolR試劑，淹沒海馬組織，并編號存放于液氮中，備用。按照TRIzolRReagent試劑盒說明書，提取大鼠海馬組織中總RNA。之后按照First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒方法，反轉(zhuǎn)錄提取的海馬組織總RNA，合成cDNA。最后按qPCR Mix試劑盒進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的檢測，采用三步法檢測目的基因mRNA的相對表達，基因的引物設(shè)計見表1，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，它屬于看家基因，在幾乎所有組織中均高效表達，在同類細胞或組織中的蛋白表達量幾乎是恒定的，并且它的蛋白表達量不受某些識別位點、誘導(dǎo)物的影響，因此常被用實時定量PCR實驗、western-bolt實驗的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參。實時定量PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，于此處收集熒光，40次循環(huán)；最后16 ℃保溫30 min。

表1 基因引物序列，退火溫度和產(chǎn)物長度Table 1 Gene primers,annealing temperature and product lengths

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果以“±s”表示，SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，并使用prism 6.0.1軟件繪圖，多組間比較采用ANOVA統(tǒng)計學(xué)方法分析，組間比較采用T檢驗，并且認(rèn)為P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚油對母鼠海馬組織NR1、CREB、c-fos mRNA表達量的影響

低劑量、中劑量和高劑量魚油對母鼠海馬組織NR1、CREB、c-fos基因mRNA表達量的Real-Time PCR結(jié)果見表2，表2顯示的結(jié)果為NR1、CREB、c-fos基因的相對表達量，設(shè)置陰性對照組的目的基因表達量為1±0。由表2可以看出，灌胃低劑量、中劑量、高劑量魚油的母鼠大腦海馬組織中NR1、CREB、c-fos三個基因均有不同程度的表達。與陰性對照組相比，魚油低劑量組和魚油中劑量組母鼠海馬組織中NR1、CREB、c-fos基因mRNA的相對表達量均顯著增高（P＜0.05），魚油高劑量組的大鼠海馬NR1、CREB、c-fos基因mRNA的相對表達量未見明顯差異；不同劑量的魚油對母鼠NR1、CREB、c-fos基因mRNA的表達量影響不同，中劑量的魚油對母鼠海馬NR1、CREB、c-fos基因的影響最大，低劑量的魚油次之。表2還顯示，魚油對不同基因的相對表達量影響不同，三個劑量組中CREB的相對表達量最高，其次是c-fos基因、NR1基因。說明攝入適當(dāng)劑量的魚油能夠增加母鼠海馬組織中與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的NR1、CREB、c-fos基因的表達，并且魚油對CREB基因的影響最大。

表2 不同劑量魚油對母鼠海馬NR1、CREB、c-fos 基因mRNA表達的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of different fish oil dosage on mRNA expression ofc-fos,CREB andNR1 in female rats’hippocampus (±s,n=6)

表2 不同劑量魚油對母鼠海馬NR1、CREB、c-fos 基因mRNA表達的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of different fish oil dosage on mRNA expression ofc-fos,CREB andNR1 in female rats’hippocampus (±s,n=6)

注：“*”表示與陰性對照組比較，基因的相對表達量有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 魚油對新生乳鼠海馬組織NR1、CREB、c-fos mRNA表達量的影響

低劑量、中劑量和高劑量的魚油對新生乳鼠海馬組織中NR1、CREB、c-fos基因mRNA表達量的影響見表3，表3中顯示的是目的基因的相對表達量，設(shè)置陰性對照組為1±0。由表3可知，三個劑量的魚油組中新生乳鼠海馬組織NR1、CREB、c-fos基因均有不同程度的表達。表3還顯示，與陰性對照組相比，魚油低劑量組和魚油高劑量組新生乳鼠海馬組織中NR1、CREB、c-fosmRNA的相對表達量均明顯增高（P＜0.05），魚油高劑量組的新生乳鼠海馬NR1、CREB、c-fos基因mRNA 的相對表達量未見明顯差異；不同劑量的魚油對新生乳鼠NR1、CREB、c-fos基因mRNA的表達量影響不同，中劑量的魚油對新生乳鼠海馬NR1、CREB、c-fos基因的影響最大，低劑量的魚油次之。表3還顯示，魚油對新生乳鼠不同基因的相對表達量影響不同，三個劑量組中，c-fos的相對表達量最高，其次是CREB基因，最后是NR1基因。說明孕期以及哺乳期攝入適當(dāng)劑量的魚油能夠顯著增加新生大鼠海馬組織中與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的NR1、CREB、c-fos基因的表達，并且魚油對CREB基因的影響最為顯著。

表3 不同劑量魚油對新生乳鼠海馬NR1、CREB、c-fos 基因mRNA表達的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of different fish oil dosage on mRNA expression ofc-fos,CREB andNR1 in newborn rats' hippocampus (±s,n=6)

表3 不同劑量魚油對新生乳鼠海馬NR1、CREB、c-fos 基因mRNA表達的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of different fish oil dosage on mRNA expression ofc-fos,CREB andNR1 in newborn rats' hippocampus (±s,n=6)

注：“*”表示與陰性對照組比較，基因的相對表達量有顯著性差異（P＜0.05）。

長時程增強（long-term potentiation，LTP）一直被公認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的分子學(xué)基礎(chǔ)、神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其與學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)系極為密切，大量的實驗[14-15]顯示學(xué)習(xí)記憶活動的變化伴隨著LTP的變化。LTP的產(chǎn)生包括LTP的形成與LTP的維持兩個階段，其過程極為復(fù)雜，其中涉及多個基因、蛋白以及信號通路。NR1是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體的亞單位，也是構(gòu)成NMDA受體復(fù)合物的關(guān)鍵亞基，與學(xué)習(xí)記憶活動關(guān)系密切。NR1參與了NMDA受體依賴型的LTP的形成，因此NR1與LTP的生成關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在經(jīng)歷空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，其NR1的蛋白表達量明顯增高，并且NR1的蛋白表達量與學(xué)習(xí)記憶成正相關(guān)[16]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白是環(huán)腺苷酸應(yīng)答無件結(jié)合蛋白，它存在于真核生物的細胞核內(nèi)，是一種轉(zhuǎn)錄增強子，可以增強特定基因的轉(zhuǎn)錄。CREB也是很多神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)因子，在大腦的生長發(fā)育、機體的晝夜節(jié)律以及LTP的產(chǎn)生中都發(fā)揮了重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CREB能夠通過調(diào)節(jié)大鼠脊柱內(nèi)側(cè)杏仁核內(nèi)的神經(jīng)元樹突棘密度來影響記憶的形成[17]。還有研究顯示[18]，阻斷CREB的糖基化修飾可以改變細胞的功能和行為的可塑性，能夠增強軸突與樹突的生長，促進長時程記憶的形成。即刻早期基因c-fos是一類原癌基因，它的主要功能是通過編碼c-fos蛋白實現(xiàn)的。c-fos與學(xué)習(xí)記憶以及LTP的生成有關(guān)，有研究[19]發(fā)現(xiàn)，c-fos的基因表達與c-fos蛋白表達與LTP存在相關(guān)性，當(dāng)LTP增強的時候，伴隨著c-fos基因mRNA表達量的增加、c-Fos蛋白表達量的增加。

實驗還顯示，新生乳鼠海馬組織中NR1、CREB、c-fos基因mRNA的相對表達量也顯著增加了，但新生乳鼠并未直接飼喂魚油，結(jié)合VAFA T S[5]等的研究結(jié)論，推測新生乳鼠海馬中基因表達增加的原因，可能是母鼠在孕期攝入足夠量的魚油，增加了乳汁中DHA與EPA的含量，乳汁中的DHA與EPA誘導(dǎo)了新生乳鼠海馬中基因的表達。進一步驗證其可能的原因有待進一步研究討論。

3 結(jié)論

從實時定量PCR的實驗結(jié)果可以看出，孕期和哺乳期補充適當(dāng)劑量的魚油，能夠提高母鼠與新生乳鼠海馬組織中NR1、CREB、c-fos的相對表達量，高劑量的魚油對母鼠和新生乳鼠海馬NR1、CREB、c-fos基因mRNA的表達量無明顯影響。由NR1、CREB和c-fos與LTP以及學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系，推測孕期適當(dāng)補充魚油，能夠調(diào)節(jié)其海馬組織中NR1、CREB和c-fos的表達，從而影響LTP的生成，最終提高母鼠以及新生乳鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。然而，學(xué)習(xí)記憶是個十分復(fù)雜的過程，涉及多個信號通路、多種生化反應(yīng)，魚油是如何發(fā)揮作用，怎樣提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的，它是如何發(fā)生的，具體過程是怎樣的，有待進一步研究討論。

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