（鄭州市兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000）

細(xì)胞支原體污染清除方法比較及清除后的應(yīng)用

錢錦

（鄭州市兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000）

目的 探討使用幾種支原體清除方法后，細(xì)胞支原體清除效果及所制備抗體應(yīng)用于相應(yīng)平臺(tái)的對(duì)比。方法 選用 4 種方法進(jìn)行清除支原體。結(jié)果 通過 PCR 法鑒定，只有清除劑法及實(shí)體瘤法可清除支原體感染。結(jié)論 雜交瘤細(xì)胞清除支原體感染后，制備所得抗體應(yīng)用于相應(yīng)平臺(tái)可見，清除劑法對(duì)細(xì)胞損傷較大，抗體相應(yīng)功能下降；而實(shí)體瘤法教溫和，抗體相應(yīng)功能保持較完好。

支原體；雜交瘤細(xì)胞；抗體

支原體是一種大小僅為0.2～0.3 μm，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22～0.45 μm）的原核生物。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到30%～60%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題[1]。當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是很普遍的問題，做好支原體污染的防治工作，是保證實(shí)驗(yàn)工作順利進(jìn)行的重要一環(huán)[2]。細(xì)胞被支原體感染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。當(dāng)污染嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢甚至凋亡。本文對(duì)傳代培養(yǎng)中的雜交瘤細(xì)胞污染支原體采用幾種方法進(jìn)行清除試驗(yàn)，將清除支原體后細(xì)胞進(jìn)行制備抗體，應(yīng)用于相應(yīng)平臺(tái)，并取得一定效果。

1 材料與方法

1.1 材料：①試劑及動(dòng)物：支原體污染檢測(cè)試劑盒購自上海依科賽（規(guī)格：MB000-1392；批號(hào)：120917）支原體清除劑Myco-1 Myco-2 Myco-3購自Applichem公司（貨號(hào)及規(guī)格A5222_0020；A5233_0020及A5240_0020），RPMI 1640培養(yǎng)基（規(guī)格及批號(hào)：10X1L，批號(hào)1146563），胎牛血清（FBS 規(guī)格及批號(hào)：500ML，210170K）購自Gibco公司；所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；雜交瘤細(xì)胞株AFP （抗甲胎蛋白單克隆抗體）2-8F9及1-12A5為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；SPF級(jí)BALB/c純系小鼠，鼠齡 6～8周，體質(zhì)量 18～22 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②儀器：Bio-red 公司MJ-MINI PCR擴(kuò)增儀；DYY-6C型電泳儀為上海京工實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品，BB15性CO2培養(yǎng)箱為美國Themo公司產(chǎn)品，TGW16型離心機(jī)為長沙英泰公司生產(chǎn)；眼科剪，眼科鑷，200目篩網(wǎng)等購自海門鴻銳。

1.2 支原體檢測(cè)方法：應(yīng)用上海依科賽公司開發(fā)的支原體檢測(cè)試劑盒（PCR快速檢查法）檢測(cè)細(xì)胞支原體感染情況。

1.3 支原體污染清除方法：①小鼠體內(nèi)（腹腔）誘生法：經(jīng)鑒定有支原體污染的雜交瘤細(xì)胞 2-8F9及1-12A5 各2×106個(gè)1200 rmp 離心5 min， 2 mL無菌生理鹽水復(fù)懸，腹腔注射4只B/C小鼠。10～14 d無菌收腹水，離心，雜交瘤細(xì)胞復(fù)懸于1640完全培養(yǎng)基中，移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第2天換液，細(xì)胞生長至24孔底60%以上檢測(cè)效價(jià)，腹水及細(xì)胞上清均轉(zhuǎn)為陰性，棄用次法。②小鼠體內(nèi)（皮下實(shí)體瘤）誘生法：經(jīng)鑒定有支原體污染的雜交瘤細(xì)胞 2-8F9及1-12A5 各5×105個(gè)1200 rmp 離心5 min，0.5 mL無菌生理鹽水復(fù)懸，各注射2只B/C小鼠皮下，20 d左右無菌回收實(shí)體瘤，于200目篩網(wǎng)研磨，離心，雜交瘤細(xì)胞復(fù)懸于1640完全培養(yǎng)基中，移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第2天換液，細(xì)胞生長至24孔底 60%以上檢測(cè)效價(jià)，無明顯下降，重復(fù)2次以上皮下實(shí)體瘤。③亞克隆法：常規(guī)方法取小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞，稀釋至大約1×106個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞板，每孔0.1 mL，將雜交瘤細(xì)胞2-8F9及1-12A5各100個(gè)種入一塊96孔細(xì)胞板中，4～5 d換液，7～8 d檢測(cè)效價(jià)，效價(jià)略降，篩選單集落亞克隆，重復(fù)3次。④抗生素法（支原體清除劑法）：使用含支原體清除劑 1% Myco-3 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)有支原體污染的雜交瘤細(xì)胞 2-8F9及1-12A5，3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d，雜交瘤細(xì)胞存在輕度污染，繼續(xù)使用同系列支原體清除劑1% Myco-1 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后換1%Myco-2 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，交替使用3個(gè)循環(huán)，每周檢測(cè)效價(jià)，無明顯下降。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理方法比較：采用前面介紹的幾種方法處理細(xì)胞以期達(dá)到清除支原體污染，但是在幾種處理污染細(xì)胞的方法比較中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞會(huì)有不同程度的損傷，見表1。

表1 細(xì)胞支原體污染去除方法比較

2.2 細(xì)胞上清效價(jià)比較：在比較細(xì)胞損傷及清除污染的同時(shí)，對(duì)于分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，我們還需要重點(diǎn)關(guān)注支原體去清除的同時(shí)是否改變的細(xì)胞原有的生物性質(zhì)，即其分泌抗體的能力是否發(fā)生改變。圖1是四種不同方法去除污染后細(xì)胞上清分泌抗體功能的比較。

從圖1中我們可以看到四種處理方法中實(shí)體瘤方法處理后細(xì)胞分泌抗體的能力與為感染前的較一致，支原體清除劑處理后細(xì)胞上清的OD值低0.2左右，亞克其次，腹腔處理方法細(xì)胞分泌抗體的功能基本丟失。

2.3 抗體應(yīng)用：對(duì)于細(xì)胞分泌抗體功能仍然保留較完整的細(xì)胞，我們擴(kuò)大培養(yǎng)，處理后的細(xì)胞進(jìn)一步制備抗體，抗體評(píng)價(jià)細(xì)胞分泌的抗體活性應(yīng)用情況。圖2是處理前后純化得到的抗體效價(jià)比較。

從圖2-1可看到2-8F9污染前及實(shí)體瘤處理后所得抗體效價(jià)相當(dāng)，抗生素處理后所得抗體效價(jià)遠(yuǎn)低于污染前抗體效價(jià)；圖2-2可看到1-12A5污染前，實(shí)體瘤處理和抗生素處理后所得抗體效價(jià)相當(dāng)。

抗AFP單克隆抗體 2-8F9 作包被材料應(yīng)用于膠體金平臺(tái)，抗AFP單克隆抗體 1-12A5 作T線包被材料應(yīng)用于熒光定量平臺(tái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)抗體性能是否發(fā)生改變，見表2和圖3。

從表2可看到污染前及處理后細(xì)胞株2-8F9所制備抗體應(yīng)用于膠體金平臺(tái)，不同包被濃度，抗生素處理的檢測(cè)值均比實(shí)體瘤處理及污染前低3個(gè)梯度以上，實(shí)體瘤處理和污染前檢測(cè)值相當(dāng)?？笰FP單克隆抗體 1-12A5 作T線包被材料應(yīng)用于熒光定量平臺(tái)?？贵w包被濃度為1.0 mg/mL，AFP濃度（ng/mL）為：14.22、41.36、81.51、161.3、434.3的熒光檢測(cè)結(jié)果見圖3。

R375

：B

：1671-8194（2014）30-0069-02