趙青松李德軍( 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工學(xué)院 湖北宜昌443000 湖北襄陽市軍事經(jīng)濟(jì)學(xué)院襄陽士官學(xué)?；鶎榆娦柘?湖北襄陽448)

2009年我市曾確診1例高致病性禽流感，給我市家禽養(yǎng)殖造成了較大損失。時(shí)隔數(shù)年，我市家禽養(yǎng)殖再次得到長(zhǎng)足發(fā)展，2013年出籠家禽3585.25萬只，規(guī)模化養(yǎng)殖比例達(dá)到74%，高致病性禽流感也得到了有效控制，但加強(qiáng)禽流感的監(jiān)測(cè)和預(yù)防仍對(duì)我市家禽養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有重要意義。為此，近期筆者再次對(duì)我市家禽養(yǎng)殖和交易市場(chǎng)的現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，以期了解流行現(xiàn)狀，并針對(duì)性與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以期找到快速監(jiān)測(cè)禽流感的有效措施。

1 材料與方法

1.1 病料的采集

1.1.1 疑似病例病料樣品的采集

通過調(diào)查走訪，對(duì)于出現(xiàn)咳嗽、噴嚏，甩頭，產(chǎn)蛋量下降，畸形蛋增多，或者死亡率增加的禽群進(jìn)行氣管咽部采樣，共采樣55份，其中肉仔雞病料樣品30份，地方土雞病料樣品25份。

1.1.2 陽性禽群血清樣品的采集

對(duì)經(jīng)ELISA檢測(cè)呈陽性的肉用仔雞群于40日齡時(shí)采集血清樣本，共采集血清樣品20份。從某鵪鶉場(chǎng)采集鵪鶉血清樣品18份。

1.1.3 交易市場(chǎng)隨機(jī)樣品的采集

分批隨機(jī)采集進(jìn)市交易的雞、鴨血清樣本，共80份。

1.2 采樣方法

1.2.1 氣管咽部樣品

用手將喙撥開，用手或鑷子將舌頭拉出，露出咽部，將棉拭子插入咽部氣管內(nèi)，攪動(dòng)幾下（盡可能多地蘸取咽部黏液），取出棉拭子放入樣品管內(nèi)（事先已加試劑盒提供的“7號(hào)液”250μL），用力攪拌、擠壓，盡可能使棉拭子上的樣品洗脫下來，棄去棉拭子，管內(nèi)的液體即為待檢樣品。

1.2.2 血清樣品

用針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至6～8cm長(zhǎng)，將管一端燒融封口，待凝固析出血清后以1000r/min，離心5min，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料板小孔中。若需要保存一段時(shí)間，可在離心后將凝血一端剪去，滴融化石蠟封口，于0℃保存。

1.3 藥品、儀器與試劑

1.3.1 試劑盒

夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)研究室提供。

1.3.2 抗原禽流感H5、H7和H9抗原，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。HA效價(jià)在1：64以上。

1.3.3 血清

禽流感H5、H7和H9陽性血清，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果

共采集樣品55份，用夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)，結(jié)果肉用仔雞30份，樣品中有26例呈陽性，比例為26/30；地方土雞25份樣品全部為陰性（見表1）。

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果

分別于肉仔雞場(chǎng)、鵪鶉場(chǎng)和交易市場(chǎng)采集樣品，其中經(jīng)夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)呈陽性的肉仔雞場(chǎng)的血清樣品20份，有明顯沉淀線的有18份，陽性比率為18/20。鵪鶉場(chǎng)血清18份，有明顯沉淀線的有18份，陽性比率為18/18。交易市場(chǎng)隨機(jī)采樣80份，其中土雞10份，肉雞35份，蛋雞10份，鴨15份，陽性比率為2/35（見表2）。

表1 夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果

表2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 HA和HI試驗(yàn)結(jié)果

采集經(jīng)夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)呈陽性的肉仔雞場(chǎng)的血清樣品20份，進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表明，H7抗原的HI價(jià)均超過24，陽性率為20/20。H5抗原的HI價(jià)有15份達(dá)到或超過24，陽性率為15/20。H9抗原孔全部出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明雞的血清不含H9亞型的抗體。

2.4 結(jié)果分析

（1）檢測(cè)結(jié)果表明，我市仍面臨著H5和H72種強(qiáng)毒株禽流感的威脅，應(yīng)給予高度重視。

（2）陽性禽群主要來自冬春季節(jié)的肉仔雞養(yǎng)殖場(chǎng)，其臨床表現(xiàn)為10日齡左右出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，咳嗽、噴嚏或甩頭，但群體精神狀態(tài)良好，采食、飲水和死亡率基本正常，使用抗生素治療無效或不理想。發(fā)病早期使用抗病毒藥物癥狀有明顯減輕，停藥則復(fù)發(fā)，20～25日齡時(shí)呼吸癥狀減輕或消失。因此，發(fā)現(xiàn)類似癥狀的雞群時(shí)，要及時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，防止禽流感病毒擴(kuò)散。

（3）本次試驗(yàn)3種方法的檢測(cè)結(jié)果基本吻合，而夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒抗原診斷試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)速度最快，檢測(cè)過程簡(jiǎn)單，操作容易，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，是進(jìn)行禽流感快速檢測(cè)的有效方法，可予以推廣使用該方法。

（4）來自集貿(mào)市場(chǎng)的陽性血清說明畜禽的頻繁流通是禽流感傳播的重要途徑。鵪鶉場(chǎng)的發(fā)病可能是該場(chǎng)從外地引種所致，也可能是進(jìn)市場(chǎng)送鮮蛋而帶毒感染。

（5）歷史上高致病性禽流感都是由H7及H5亞型成員引起，但并非H5和H7都是強(qiáng)毒。本次調(diào)查中肉雞場(chǎng)的毒株雖然為H7及H5亞型，但雞群發(fā)病后只在臨床上表現(xiàn)出明顯的呼吸道癥狀，而采食、飲水、糞便和死淘率基本正常。

（6）針對(duì)本次檢測(cè)結(jié)果，我市禽流感的免疫預(yù)防可以選擇H5亞型流行株同分支的疫苗進(jìn)行免疫。免疫程序可設(shè)計(jì)為：肉雞5～7天，0.3mL皮下注射，保護(hù)整個(gè)生長(zhǎng)期。種雞和蛋雞7～10天，0.3～0.5mL皮下注射；18～20天加強(qiáng)免疫，0.5mL胸肌注射；50～60天再接種1次，0.5mL胸肌注射；經(jīng)3～6個(gè)月再免疫1次。