馮秀紅 曹建偉 陸巧芬 馮開容 陳修鄧 劉廣芹 關建新

（廣東省江門市動物疫病預防控制中心 廣東江門 529000）

自2013年4月報道人感染H7N9流感以來，禽流感疫病的防控與監(jiān)測再一次引起社會各界的關注[1-2]。用于禽流感病毒的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的病毒分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法等，其中分子生物學方法有著靈敏、特異、快速、準確及易于操作等優(yōu)點，成為當前禽流感病毒檢測的主要發(fā)展方向[3]。江門市動物疫病預防控制中心在嚴格進行日常的禽流感疫病監(jiān)控的同時，通過增加對活禽批發(fā)市場的抽樣檢測數(shù)量，及時監(jiān)測并掌握疫病特別是禽流感疫病的流行及發(fā)展動態(tài)。對于所采集到的禽流感樣品，如，咽/泄殖腔拭子、環(huán)境樣品等，從經(jīng)濟、方便和快捷的角度考慮，疫控中心一向選用膠體金方法進行檢驗。但面對來勢洶洶的禽流感，要提高檢測的準確度和檢測速度就要求采用檢測結果更準確的國標熒光RT-PCR法，此法具有用樣少、特異性強、敏感性高及快速準確等特點，大大縮短了對AIV的檢出時間，為我國禽流感的綜合防制提供了先進、有效的早期快速診斷技術[4]。

本著“公正、科學、準確、高效”的實驗室管理方針，為確保對禽流感疫病檢測結果的準確性，自2013年10月起，實驗室就嘗試采用不同的檢測方法進行比對試驗，通過對江門市區(qū)內(nèi)耙沖市場、江南批發(fā)市場及新會奇榜市場3個活禽交易批發(fā)市場每月2次隨機定量抽樣，然后對抽取的樣品采用膠體金與國標熒光RT-PCR2種方法進行檢測結果比對試驗，根據(jù)實驗結果分析選取最合適的實驗檢測方法。得出結論是為了確保檢測的準確性，在重要和關鍵時期，選用熒光RT-PCR樣品進行檢測是比較合適的。膠體金法檢測相對熒光RT-PCR法有一定漏檢和誤檢現(xiàn)象，只適用于正常時期的一般性檢測。

1 研究內(nèi)容

1.1 實驗材料

實驗樣品采集要求：每月隨機2次，到3個市場采集至少3個不同品種的禽只各10份咽/泄殖腔拭子[5]、10份環(huán)境樣品（混樣）。

1.2 實驗試劑

禽流感快速檢測條（廣州瑞森生物科技有限公司），韓國Anigen禽流感快速診斷試劑卡（韓國Anigen），禽流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒（深圳澳東檢驗檢測科技有限公司），內(nèi)含RNA提取液、反應液、陽性對照、陰性對照、tap酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RT-PCR反應液和DEPC水；自備：氯仿、異丙醇和75%酒精。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光RT－PCR法(參照禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法（GB/T19438.2-2004）)

（1）取若干個Eppendorft管，分別加入陰陽對照和已處理的樣品200μL，加入裂解液600μL，吸打混勻，再加入200μL氯仿，振蕩混勻，靜置5min，12000rpm離心10min。

（2）吸取上層液相轉(zhuǎn)入新的eppendorft 管 中 ， 再 加 入400μL-20℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，靜置5min，12000rpm離心10min。

（3） 輕輕倒去上清，加入700μL75%乙醇，顛倒?jié)櫹磶状危?2000rpm離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。

（4）4000rpm離心10s，用微量移液器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1～5min。

（5）加入15μLDEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上的RNA，-18℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）每份總體積25μL。取19μLRT-PCR反應液 (用前混勻)、0.5μLtap酶、0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶，5μL樣品RNA。反應體系配制如表1。

（7）取20μL反應體系配制液，分裝成n份，分別加入5μL樣品RNA。做好標記，在熒光PCR儀上進行以下循環(huán)：50℃20min，95℃3min；擴 增 條 件 為95℃5s，55℃20s，72℃20s，5個循環(huán)95℃5s，60℃40s，40個循環(huán)，在60℃處收集熒光。

1.3.2 膠體金法

操作方法[6]：將采集樣品浸入樣品稀釋液，充分攪拌混勻后，靜置少許時間，用一次性滴管取上清液（樣品若不能立即測試，應冷藏保存，超過24小時，應冷凍保存）。將未開封的試紙卡和檢測樣品恢復至室溫。將試紙卡水平放置，用滴管向試卡孔緩慢逐滴加入3滴不含氣泡的檢測液，5分鐘判斷結果。

2 結果與分析

膠體金法和熒光RT-PCR法檢測3次（91、96、96份）拭子抗原，結果見表2、表3和表4。

（1）由表1可見，2013年10月15日91份拭子，用膠體金法（瑞森）檢測禽流感抗原，陽性23份，陽性率25.27%；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性21份，陽性率23.08%。2013年11月5日96份拭子，用膠體金法（瑞森）檢測禽流感抗原，陽性23份，陽性率23.96%；用膠體金法（韓國Anigen）檢測禽流感抗原，陽性0份，陽性率0；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性22份，陽性率22.92%。2013年11月12日96份拭子，用膠體金法（韓國Anigen）檢測禽流感抗原，陽性1份，陽性率1.04%；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性22份，陽性率22.92%。

表1 反應體系

表2 膠體金法和熒光RT-PCRifc檢測禽流感抗原結果數(shù)據(jù)匯總

表3 膠體金法（瑞森）和熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原結果符合情況

表4 膠體金法（韓國Anigen）和熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原結果符合情況

（2）由表2可見，2種方法檢測結果不相符的有81份。其中38份膠體金法（瑞森）為陰性，熒光RT-PCR法檢測為陽性；43份體金法（瑞森）為陽性，熒光RT-PCR法檢測為陰性。由表3可見，2種方法檢測結果不相符的有85份。其中44份膠體金法（韓國Anigen）為陰性，熒光RT-PCR法檢測為陽性；1份膠體金法（韓國Anigen）為陽性，熒光RT-PCR法檢測為陰性。膠體金法檢測相對熒光RT-PCR法有一定漏檢和誤檢現(xiàn)象存在。

（3）由表2可見，相對熒光RT-PCR法檢測，膠體金法（瑞森）檢測陽性（a）為3份，陰性（d）為103份，假陽性（b）為43份，假陰性（c）為38份。膠體金法檢測靈敏度＝a/(a+c)×100%＝7.32%；特異度＝d/(b+d)×100%＝70.55%；漏檢率＝c/(a+c)×100%=92.68%;誤診率＝b/(b+d)×100%＝29.45%；診斷符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝56.68%。由表3可見，相對熒光RT-PCR法檢測，膠體金法（韓國Anigen）檢測陽性（a）為0份，陰性（d）為147份，假陽性（b）為1份，假陰性（c）為44份。膠體金法檢測靈敏度＝a/(a+c)×100%＝0%；特異度＝d/(b+d)×100%＝99.32%；漏檢率＝c/(a+c)×100%=100%;誤診率＝b/(b+d)×100%＝0.67%； 診斷符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝76.56%。

（4）從分析可知，兩家公司的速測條檢測結果假陰與假陽性情況都比較嚴重，假陽性使正常健康的禽只被誤診為患病禽只，這對養(yǎng)殖戶與銷售檔主都可能帶來不必要的損失，而假陰性使患病禽只被誤診為正常健康禽只，則不能及時有效地發(fā)現(xiàn)疫病的發(fā)生并杜絕疫病的傳播，這對于禽流感疫病的監(jiān)測防控是一個嚴重的漏洞。

（5）膠體金法因其使用方便，檢測時間短，而且成本較低，面對大量檢測的樣品，可以相對降低實驗經(jīng)費的支出，節(jié)省時間，但結果誤差率較大，尤其是假陽性率過高；熒光RT-PCR檢測結果準確，但其試劑相對較貴，實驗步驟復雜，實驗硬件要求高，面對大量檢測時，在時間與經(jīng)費方面考慮，都存在實質(zhì)性的可行性操作問題。為了確保檢測的準確性，在重要和關鍵時期，選用熒光RT-PCR樣品進行檢測是比較合適的。這次研究試驗為今后的工作開展指明了方向。

[1]孫國根，記者王春項錚，發(fā)現(xiàn)新型人感染H7N9禽流感病毒[N].科技日報，2013年4月13日第001版.

[2]通訊員朱海洋，記者潘劍凱，H7N9禽流感研究取得重大突破[N].光明日報，2013年4月28日第002版.

[3]柯艷坤，陳曉春，齊巖，等.禽流感病毒檢測方法的研究進展[J].中國家禽，2008年第30卷第14期.

[4]EspyMJ,UhlJR,SloanLM,etal.Real-timePCRinclinicalmicrobiology:applicationsforroutine laboratorytesting[J].ClinMicrobiol Rev,2006,19(1):1652256.

[5]包紅梅，王秀榮，劉麗玲，等.禽流感病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2006,36(09):701-706.

[6]彭伏虎，胡思順，王政，等.通用型禽流感病毒膠體金快速檢測試紙條的研制與應用研究[C].首屆中國獸藥大會——獸醫(yī)生物制品學、獸醫(yī)微生物學學術論壇論文集（2008）.

[7]向林遠，杜國芹.膠體金法與ELISA法檢測豬瘟抗體結果對比分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2012年7月10日第8期.