李鐵成，馬寶豐，李德生，艾麗麗，艾 浩

（遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院，錦州 121000）

·中藥研究·

黃芪甲苷對大鼠肝缺血/再灌注損傷的保護作用*

李鐵成，馬寶豐，李德生，艾麗麗，艾 浩

（遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院，錦州 121000）

[目的]研究黃芪甲苷對肝缺血/再灌注損傷的保護作用及其機制。[方法]將雄性SD大鼠36只，隨機分為3組：假手術組（Sham組）、肝缺血/再灌注組（I/R組）、黃芪甲苷預處理組（AsIV組）。分光光度法測定大鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織形態(tài)學變化，蛋白印跡法（Western blot）檢測心肌組織內Bax,Bcl-2蛋白表達。[結果]與假手術組比較，肝I/R組ALT、AST活性顯著增高，Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低，黃芪甲苷預處理可以降低肝缺血/再灌注損傷引起的ALT、AST活性增高，Bax蛋白表達增加，增加Bcl-2蛋白表達。[結論]黃芪甲苷預處理對肝缺血/再灌注損傷有一定的保護作用，其機制可能與黃芪甲苷抑制肝細胞凋亡有關。

黃芪甲苷；肝缺血/再灌注損傷；細胞凋亡

肝缺血/再灌注損傷指各種原因導致肝臟血流中斷或不足使肝臟缺血，當恢復血供再灌注后，肝細胞的功能代謝障礙及結構破壞反而加重。通過傳統(tǒng)醫(yī)學手段防治組織的缺血/再灌注損傷具有重要的臨床意義。中藥黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，味甘，性溫，乃補氣之圣藥。黃芪甲苷是從黃芪中分離得到的一種具有多種藥理活性的皂苷類化合物，其具有抗炎抗氧化、抗自由基、降血糖血脂、器官保護等廣泛的藥理作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有抗乙型肝炎病毒的潛力，保護肝臟免受病毒侵害[5]。在肝移植的大鼠模型中，黃芪甲苷的預處理可以通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF－α），抑制核因子－κB（NF－κB）轉錄活性，進而減輕肝移植術后缺血/再灌注損傷的程度，提高術后存活率[6]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡是肝缺血/再灌注損傷中重要的病理過程，黃芪甲苷是否可以通過抑制肝細胞凋亡進而發(fā)揮對缺血肝臟的保護作用，目前尚不清楚。本研究擬建立大鼠肝缺血/再灌注損傷模型，進一步探討黃芪甲苷對肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠36只，體質量（260±40）g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷，成都曼斯特生物科技有限公司。谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Bax,Bcl-2一抗購自SANTA CRUZ公司。

1.3 分組及給藥 36只SD大鼠隨機分為：1）假手術組（Sham組）：只開腹不阻斷血流。2）肝缺血/再灌注組（I/R組）。3）黃芪甲苷預處理組60mg/kg（AsIV組）。黃芪甲苷預處理組手術前5 d開始灌胃給藥，每日1次。模型組和假手術組灌等體積的生理鹽水。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 大鼠手術前12 h禁食，自由飲水，仰臥位固定麻醉。上腹部正中切口，顯露第一肝門，用小號無創(chuàng)傷血管夾鉗夾肝蒂，阻斷門靜脈,肝動脈和膽總管，造成肝缺血，同時腹腔注射（ip）給予肝素每只200 U防治凝血，30 min后松開血管夾恢復肝血供，關閉腹腔分別在各時間點取血液和肝組織標本。

1.4.2 AST、ALT活性測定 分別于術前，再灌注2、4、6 h取血，按試劑說明書操作測定各組大鼠血清中AST、ALT含量。

1.4.3 肝組織形態(tài)學觀察 再灌注6 h后，取缺血區(qū)肝組織于4%的多聚甲醛中固定12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5 μm，切片常規(guī)脫蠟脫水，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，普通光學顯微鏡觀察肝臟組織病理改變。

1.4.4 Bax、Bcl-2蛋白表達測定 再灌注6 h后，取缺血區(qū)肝組織置于-70℃冰箱備用。測定時取出樣品，放入裂解液超聲裂解組織，離心，取上清液，采用二喹啉甲酸法（BCA法）進行蛋白定量。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標準物點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Maker的移動情況，適時終止電泳。轉膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的Bax,Bcl-2一抗4℃雜交過夜，然后用洗膜液洗膜3次，與二抗反應至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機檢測。

1.4.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析結果，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ALT、AST活性的測定 肝缺血/再灌注后肝功能指標AST、ALT持續(xù)增高，黃芪甲苷預處理可以在不同時間點不同程度的降低AST、ALT活性（P< 0.05），提示黃芪甲苷的預處理對肝缺血/再灌注的肝功能有一定的保護作用。見表1、表2。

表1 不同時間點ALT活性的變化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

表1 不同時間點ALT活性的變化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，＃P<0.05。

組別 n Sham組 12 65±12 70±13 64±16 59±11 I/R組 12 68±18 367±32* 752±142* 1 087±121* AsIV組 12 78±17 98±15＃109±24＃128±29＃0 h 2 h 4 h 6 h

表2 不同時間點AST活性的變化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

表2 不同時間點AST活性的變化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，＃P<0.05。

組別 n Sham組 12 50±12 63±14 47±11 64±10 I/R組 12 63±13 312±18* 789±56* 1 247±89* AsIV組 12 69±12 74±19＃132±34＃153±121＃0 h 2 h 4 h 6 h

2.2 肝組織形態(tài)學的變化 假手術組大鼠肝組織結構清晰，以中央經(jīng)脈為中心肝細胞呈放射狀排列，胞漿深染，匯管區(qū)無炎性細胞侵潤。模型組肝組織中大量炎性細胞聚集浸潤，以中央靜脈為甚，肝竇變窄，肝索排列紊亂，可見肝細胞水腫及空泡樣變性，偶見點狀壞死。黃芪甲苷預處理可部分改善上述肝組織的形態(tài)學變化。

2.3 黃芪甲苷對Bax,Bcl-2蛋白的影響 見圖2。示肝臟缺血/再灌注后抗凋亡基因Bcl-2表達降低、促凋亡基因Bax表達增加。而黃芪甲苷預處理可以部分逆轉上述改變，提示黃芪甲苷預處理可以抑制肝缺血/再灌損傷中凋亡的發(fā)生。

圖1 肝組織形態(tài)學變化Fig.1 The changes of liver pathological

圖2 Bax、Bcl-2蛋白表達Fig.2 The protein expression of Bax,Bcl-2

3 討論

肝缺血/再灌注損傷在臨床上比較常見，如肝腫瘤切除、肝移植、休克等，是導致肝功能衰竭的重要原因，目前認為其發(fā)生機制可能與氧自由基爆發(fā)、微循環(huán)功能障礙、凋亡及炎癥因子的激活等密切相關[7-9]。本實驗通過建立大鼠肝缺血/再灌注模型，觀察了黃芪甲苷預處理對肝缺血/再灌注損傷時肝細胞凋亡的影響，結果顯示，黃芪甲苷預處理可以不同程度的降低缺血/再灌注后AST、ALT含量，抑制肝組織的形態(tài)學變化，提示黃芪甲苷預處理對肝缺血/再灌注損傷有一定的保護作用。

細胞凋亡是細胞死亡形式之一，近來發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與肝缺血/再灌注損傷密切相關，采取有效的措施干預細胞凋亡，可減輕肝臟缺血/再灌注損傷。Bcl-2家族是細胞通過線粒體途徑促進凋亡的重要調節(jié)因子，Bcl-2家族有兩個重要的凋亡調控因子，即Bax和Bcl-2。Bax主要分布在線粒體外膜上，它的過表達可誘導細胞凋亡。而Bcl-2是抗凋亡因子，當Bax表達量高時，形成同源二聚體Bax/Bax，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，而誘導細胞凋亡[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)對肝缺血/再灌注損傷的保護作用可通過增加Bcl-2表達，抑制Bax表達實現(xiàn)。本實驗通過電泳法探討了黃芪甲苷對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，結果顯示肝缺血/再灌注后Bcl-2表達降低，而Bax表達增加，與模型組相比黃芪甲苷預處理則可增加抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制促凋亡基因的表達，抑制凋亡信號的傳導，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。

有報道黃芪甲苷的預處理可抑制炎癥反應，抑制NF-κB通路的活化，預防小鼠肝臟缺血/再灌注損傷的發(fā)生[13]。黃芪甲苷大鼠常用劑量為20～80mg/kg[14]，本研究結合前期預實驗結果探討了60 mg/kg黃芪甲苷在整體動物水平上對肝缺血/再灌注損傷的保護作用，結果提示黃芪甲苷可能通過抑制肝細胞凋亡，進而發(fā)揮對肝缺血/再灌注損傷的保護作用，這一結論為中藥黃芪的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

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Protective effect of Astragaloside IV against liver ischemia and reperfusion injury in rats

LI Tie-cheng,MA Bao-feng,LI De-sheng,AI Li-li,AI Hao
（The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China）

[Objective]To investigate the protective effect of Astragaloside IV (As IV)against liver ischemia and reperfusion injury and the underlying mechanism.[Methods]The 36 SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operation group (Sham group),liver ischemia-reperfusion (I/R group)group and As IV group.The content of ALT and AST were measured by spectrophotometric method. Liver pathological changes were observed by HE staining.Bax and Bcl-2 protein expression was determined by Western blot.[Results] Compared with sham group,the content of ALT and AST was significantly increased,while the Bcl-2 protein expression decreased and the Bax expression increased.Pretreatment of As IV before liver I/R could decrease the content of ALT and AST,Bax expression,and increase the Bcl-2 protein expression(P＜0.05).[Conclusion]As IV pretreatment has a protective effect against liver ischemia reperfusion injury,which is partially finished via inhibiting liver cell apoptosis.

Astragaloside IV;liver ischemia reperfusion injury;cell apoptosis

R285.5

A

1672-1519（2014）10-0621-03

2014-05-15）

（本文編輯：高 杉，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.12

國家自然科學基金資助項目（81173443）；遼寧省教育廳資助科研資助項目（LJQ2011087）。

李鐵成（1970－），男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為圍術期器官保護。