王 靜，王緒霖，楊 強

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化科，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科，天津 300052）

·實驗研究·

滌痰散結(jié)活血軟堅中藥對非酒精性脂肪肝大鼠血清白介素-6、超氧化物歧化酶表達的影響

王 靜1，王緒霖2，楊 強1

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化科，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科，天津 300052）

[目的]通過觀察滌痰散結(jié)活血軟堅中藥對非酒精性脂肪肝大鼠血清白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）表達的影響，探討復方中藥的作用機制。[方法]雄性SPF級Wistar大鼠60只，按體質(zhì)量分層隨機分為4組：正常對照組14只，自由飲水和普通飼料飲食。模型對照組18只，中藥高劑量組14只，中藥低劑量組14只，均予自由飲水和高脂飼料飲食，8周后隨機處死模型對照組大鼠4只，確定脂肪肝模型成立。造模成功后，分別對中藥低劑量組和高劑量組行中藥灌胃，模型對照組、正常對照組以生理鹽水灌胃，每周稱大鼠體質(zhì)量，治療8周后處死，采用ELISA法檢測血清IL-6、SOD。[結(jié)果]大鼠血清IL-6比較：高劑量組、低劑量組與模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.01），高劑量組與低劑量組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。大鼠血清SOD比較：高劑量組與模型對照組比較，差異有顯著性（P＜0.01），低劑量組與模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.05），高劑量組與低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。[結(jié)論]滌痰散結(jié)活血軟堅中藥可以顯著減低血清IL-6濃度，此作用表現(xiàn)出劑量相關(guān)性趨勢，可以明顯升高血清SOD濃度，此作用沒有體現(xiàn)出劑量相關(guān)性趨勢。

非酒精性脂肪肝；滌痰散結(jié)活血軟堅法；白介素-6；超氧化物歧化酶

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是肝細胞內(nèi)大量甘油三酯聚集而引起的臨床病理綜合征，肝的組織學改變與酒精性肝病（ALD）相似，但無過量飲酒史。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、NASH相關(guān)肝纖維化和肝硬化。其發(fā)病機制尚不完全清楚，可能是遺傳環(huán)境、代謝應激等所致，常與肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗（IR）等代謝綜合征相關(guān)[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分泌的脂肪因子對誘導和加重IR有重要作用。本研究采用高脂飲食建立脂肪肝大鼠模型，觀察滌痰散結(jié)活血軟堅中藥對大鼠血清白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）表達的影響，進一步探討復方中藥的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量為（188±10）g，由北京軍事科學院提供，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，室溫18～24℃，明暗各12 h清潔級動物實驗室。

1.2 主要試劑和藥物 膽固醇：納瑞增（天津）生物科技有限公司。IL-6試劑盒：天津嘉格生物科技有限公司。SOD試劑盒：天津嘉格生物科技有限公司。滌痰散結(jié)活血軟堅法藥物組成：丹參20 g，金錢草30 g，生牡蠣20 g，海藻15 g，草決明20 g，虎杖15 g，何首烏20 g，夏枯草15 g，由天津醫(yī)大總醫(yī)院中藥房代煎。

2 方法

2.1 模型制備與分組 在動物房內(nèi)適應性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機分為4組，包括正常對照組14只、模型組18只、中藥高劑量組14只、中藥低劑量組14只。

正常對照組飼以普通飼料，其余3組均飼以高脂飼料，實驗動物自由進食和飲水。高脂飼料：84%基礎飼料，4%蛋黃粉，10%豬油，2%膽固醇。

2.2 標本制備 8周后隨機處死模型對照組大鼠4只，確定脂肪肝模型成立。造模成功后，分別對低劑量組和高劑量組以每日生藥1.28 g/100 g和每日生藥2.56 g/100 g行中藥灌胃，模型對照組、正常對照組以生理鹽水灌胃，每周稱大鼠體質(zhì)量，治療8周后處死，取血待測。

2.3 血清IL-6、SOD的測定 均采用ELISA法，嚴格按試劑盒說明書流程檢測。

3 統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較計量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 一般情況 實驗中，高脂飲食大鼠較正常組體質(zhì)量增加迅速，且模型組大鼠反應靈敏性下降，不喜動。灌胃開始，第1周由于操作手法不熟練，高劑量組和低劑量組各5只大鼠、模型對照組4只大鼠因藥液嗆肺死亡。實驗過程中，除8周時處死4只模型對照組大鼠、取血前處死2只正常對照組大鼠練習操作，共死亡14只，剩余大鼠共40只。

4.2 大鼠血清IL-6的測定結(jié)果 模型對照組升高，與正常對照組比較差異有顯著性（P＜0.01），高劑量組、低劑量組降低，與模型對照組比較均差異有顯著性（P＜0.01），高劑量組與低劑量組比較差異有顯著性（P＜0.05），表明高低劑量的復方中藥在降低血清IL-6濃度水平方面效果肯定，且效果與藥物劑量有相關(guān)性，見表1。

表1 大鼠血清IL-6濃度變化（±s）Tab.1 Change of serum IL-6 in rats（±s）ng/L

表1 大鼠血清IL-6濃度變化（±s）Tab.1 Change of serum IL-6 in rats（±s）ng/L

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，##P＜0.01。

組別 n IL-6濃度正常對照組 12 87.63±10.25模型對照組 10 114.77±12.40**低劑量組 9 100.64±7.90##高劑量組 9 89.93±12.60##

4.3 大鼠血清SOD的測定結(jié)果 模型對照組降低，與正常對照組比較差異有顯著性（P＜0.01），高劑量組升高，與模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.01），低劑量組升高，與模型對照組比較差異有顯著性（P＜0.05），高劑量組與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明高低劑量的復方中藥均可以確切的升高血清SOD活性水平，見表2。

表2 大鼠血清SOD活性水平變化（±s）Tab.2 Change of serum SOD in rats（±s）U/L

表2 大鼠血清SOD活性水平變化（±s）Tab.2 Change of serum SOD in rats（±s）U/L

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n SOD活性正常對照組 12 92.12±15.91模型對照組 10 68.95±13.07**低劑量組 9 84.56±14.79#高劑量組 9 90.30±16.22##

5 討論

近年來，由于生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，中國脂肪肝發(fā)病率有上升趨勢[3]。

NAFLD根據(jù)癥狀、體征可歸為中醫(yī)學的“脅痛”、“肥氣”、“肝著”、“痰濁”、“積聚”等范疇[4-5]。本病的病位主要在肝，涉及脾、胃、膽、腎等多個臟腑。脾失健運，水谷精微運化失常，痰濕內(nèi)生，蘊而為病。腎中精氣不足，導致蒸騰氣化失司，津液內(nèi)停，停聚成為痰濕。腎陽虧虛，影響及脾，脾陽亦虛，健運無力，亦可生成濕痰，此即所謂“脾主濕，濕停則為痰。腎主水，水泛亦為痰”。此外肝失疏泄，氣機郁滯，橫逆犯脾，亦可致脾失運化，水谷精微（可包括脂肪等）不歸正化，形成痰濕脂濁內(nèi)生。痰濕內(nèi)停閉阻于肝經(jīng)，肝氣郁滯，氣滯則血行不暢，又可形成瘀血，痰濁瘀血相互交結(jié)遂成本病。

天津中醫(yī)藥大學阮士怡教授從醫(yī)70余年，從事老年病尤其致力于心血管疾病的研究，早年他提出“益腎健脾，滌痰軟堅散結(jié)”法治療疾病。受阮士怡教授學術(shù)思想的指導和啟發(fā)，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科王緒霖主任將阮士怡教授的治法應用于消化系統(tǒng)疾病脂肪肝、肝纖維化、自身免疫性肝病、以及慢性胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的治療中得到可喜的療效。

本方中重用丹參、生牡蠣為君藥，以滌痰祛瘀、活血軟堅，丹參還能養(yǎng)肝血，化死血，生新血；夏枯草、海藻為臣藥，助君藥加強活血滌痰，軟堅散結(jié)功效，又能清泄肝熱；草決明、虎杖、金錢草為佐使藥，既助祛濕化痰，又可利水通便，使?jié)嵝坝谐雎?；何首烏養(yǎng)陰血、補肝腎[6]。諸藥配伍共奏祛痰化瘀，清熱利濕，軟堅散結(jié)之功效，又配伍養(yǎng)血之首烏，使清利而不傷陰，活血而不耗血，全方用藥痰瘀同治，邪毒從二便而解，使氣機暢、痰濕化、瘀血去，腑氣通，從而恢復肝膽的正常功能。

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)：丹參有降低血脂、保護肝臟的作用。夏枯草有降脂、保肝和抗氧化的作用，夏枯草多糖對自由基及亞硝酸根離子具有一定的清除能力，具有防止膜脂質(zhì)過氧化、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成、改善血液流變學部分指標的作用[7-8]。海藻中的非飽和脂肪酸能降低血清及肝臟中膽固醇的含量。草決明能顯著抑制肝損傷時機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應，提高血清以及肝臟組織內(nèi)超氧化物歧化酶抗氧化活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，進而調(diào)節(jié)肝病變時體內(nèi)的氧化應激反應[9]，達到保護肝臟的目的?；⒄燃鍎┠苊黠@對抗四氯化碳（CCl4）引起的大鼠肝損傷，顯著降低血清天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量[10]，還可促進損傷肝組織的微循環(huán)，抑制白細胞、血小板與肝臟內(nèi)皮細胞的黏附，促進肝細胞再生修復的能力，其有效成分白藜蘆醇可明顯拮抗二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化[11]，并能減少細胞氧自由基（ROS）生成，降低細胞死亡率。何首烏對多種高脂動物模型都有明顯降脂作用。

IL-6是一種由T細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞分泌的細胞因子，是經(jīng)典的炎癥因子，同時也是具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的脂肪因子，正常人脂肪組織可分泌IL-6。Wieckowska等發(fā)現(xiàn)NASH患者其肝臟IL-6的表達要遠高于單純性脂肪肝患者及正常人，認為IL-6可能與NASH的發(fā)展有密切聯(lián)系。

近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，由高脂飲食和飲酒所致混合性脂肪肝及脂肪性肝炎呈上升趨勢[12]。高脂飲食所誘發(fā)的極低密度脂蛋白（VLDL）、甘油三酯（TG）和游離脂肪酸（FFA）含量增高，以及伴隨的高密度脂蛋白水平下降和腸源性內(nèi)毒素血癥，使肝臟Kupffer細胞聚集、增生、激活并分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、IL-6等細胞因子[13-15]，導致生物膜的損傷。

IL-6可通過抑制脂蛋白酯酶的活性，阻抑脂肪分解，增加脂肪儲存，從而使循環(huán)中TG水平升高，進而促進脂肪肝的形成。近年來研究表明，肥胖癥患者的血清IL-6水平升高，低能量飲食能顯著降低脂肪組織和外周血中的IL-6水平[16]。IL-6與瘦素有相同的信號傳導通路，都須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）家族中的STAT1、STAT3才能發(fā)揮效應，因此IL-6可能與瘦素競爭STAT結(jié)合位點，導致瘦素不能發(fā)揮作用，形成瘦素抵抗，造成高胰島素血癥、IR綜合征，從而參與脂肪肝的發(fā)病[17]。IL-6作為刺激因子還可直接刺激肝細胞、儲脂細胞及庫普弗（Kupffer）細胞增生分泌膠原、層黏蛋白和蛋白多糖，參與肝纖維化的形成[18]。臨床上抑制IL-6的活性可能是防止肝纖維化的有效途徑和手段。

超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于需氧代謝細胞中一種重要的ROS清除劑，是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，此酶能催化氧自由基歧化反應，清除超氧離子自由基，進而避免當體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時引起細胞損傷的不良反應[19-21]。過量自由基可與生物膜中多價不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物（LPO），破壞生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，造成肝組織細胞損傷。SOD反映了肝細胞抗氧化能力，在機體氧化和抗氧化平衡中有著至關(guān)重要的作用。目前人們通常檢測SOD的活力可以評價機體的抗氧化損傷的能力。

滌痰散結(jié)活血軟堅中藥可以顯著減低血清IL-6濃度，減輕炎性反應，減少其誘導的細胞凋亡和胰島素抵抗，保護肝細胞，且此作用表現(xiàn)出劑量相關(guān)性趨勢，可以明顯升高血清SOD活性，可以減少不穩(wěn)定的超氧化離子等的產(chǎn)生，減輕肝細胞氧化應激反應，但此作用沒有體現(xiàn)出劑量相關(guān)性趨勢，其確切的作用機制尚有待進一步的研究。

[1]NannipieriM,Gonzales C,Baldi S,et al.Liver enzymes,the metabolic syndrome,and incident diabetes:the Mexico city diabetes study[J]. Diabetes Care,2005,28(7):1757-1762.

[2]向國卿,孟憲云,張 浩,等.脂肪肝相關(guān)危險因素的評估[J].世界華人消化雜志，2009,17(10):1038-1041.

[3]王 威,李 智,陸 怡,等.疏肝導濁方藥治療非酒精性脂肪肝的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥大學學報,2010,29(3):123-125.

[4]李玉紅,江海濤,蘇 菁,等.降脂清肝顆粒干預脂肪肝家兔脂質(zhì)代謝作用研究[J].天津中醫(yī)藥,2010,27(4):328-330.

[5]孔祥廉,梅全喜,高玉橋,等.中醫(yī)藥治療脂肪肝的分析探討[J].時珍國醫(yī)國藥,2003,14(12):781.

[6]王 威,江海濤,史 紅,等.疏肝導濁方對脂肪肝家兔的AST、ALT、ALP、NO、SOD和MDA的影響[J].天津中醫(yī)藥,2010,27(1): 9-11.

[7]章圣朋,鄧子煜,黃 成,等.夏枯草總?cè)茖λ穆然贾录毙愿螕p傷大鼠的保護作用[J].安徽醫(yī)科大學學報,2012,47(9):1054-1058.

[8]李 良.夏枯草藥理作用研究[J].中醫(yī)中藥,2013,51(4):120-121.

[9]馬 路,江夢溪,劉劍剛,等.決明子和山楂組分配伍對兔肝細胞膜高密度脂蛋白受體活性的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2009, 15(1):24-28.

[10]胡宗禮,黃曉萍.虎杖方劑對四氯化碳致大鼠肝損傷的保護作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3):657-658.

[11]單中杰,郭 亮,侯箐嵐,等.白藜蘆醇對人腎細胞癌786-0細胞周期、凋亡及PDCD5mRNA表達的影響[J].鄭州大學學報,2012, 47(2):182-184.

[12]王 威,王子旭,田 維,等.中藥單體對HepG2細胞株脂代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響[J].天津中醫(yī)藥大學學報,2011,30(2): 98-101.

[13]McClain CJ,Barve S,Dohn L,et al.Cytokines in alcoholic liver disease[J].Semin Liver Dis,1999,19(2):205-219.

[14]Shoelson SE,Herrero L,Naaz A.Obesity,inflammation and insulin resistance[J].Gastroenterology,2007,132(2):2169-2180.

[15]周婷婷,秦 波.脂肪細胞因子與非酒精性脂肪肝和胰島素抵抗關(guān)系的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(1):3014-3018.

[16]高春芳.肥胖相關(guān)肝病的常見生物化學改變[J].中華肝臟病雜志, 2004,12(7):433.

[17]成其訊,趙 勇.IL-6在癌性惡病質(zhì)中的作用可能是因其降低小鼠脂肪組織3T3-L1脂肪組織的脂蛋白酯酶活性[J].國外醫(yī)學:免疫學分冊,1993,16(5):284-285.

[18]Clarien P,Camargo CA,Gorczynski R,et al.Acute reactant cytokines and neutrophil adhesion after warm ischemia in cirrhotic and noncirrhotic human livers[J].Hepatology,1996,23(6):1456-1463.

[19]楊牧祥,張一昕,耿蘭書,等.脂肝泰膠囊對高脂血癥性脂肪肝患者SOD和MDA的影響[J].河北中醫(yī)藥學報,2002,17(4):1.

[20]Finelli C,Tarantino G.What is the role of adiponectin in obesity related non-alcoholic fatty liver disease?[J].World J Gastroenterol, 2013,19(6):802-812.

[21]Kumar R,Prakash S,Chhabra S,et al.Association of proinflammatory cytokines,adipokines＆oxidative stress with insulin resistance＆non-alcoholic fatty liver disease[J].Indian J Med Res,2012, 136(2):229-236.

Effects on the traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian on the expression of IL-6, SOD in rats with nonalcoholic fatty liver disease

WANG Jing1,WANG Xu-lin2,YANG Qiang1
（1.Digestion Department,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Digestion Department,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China）

[Objective]To establish a model of fatty liver induced by fat-rich diet in rats，observe the effect of the traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie(clearing away phlegm and dispersing the accumulation),Huoxue Ruanjian(activating blood circulation and softening the hard mass)on the expression of IL-6,SOD and discuss the mechanism of Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian method. [Methods]Sixty male Wistar rats(SPF level)were randomly divided into 4 groups according to the weight:control group(n=14),fed normal diet;model group(n=18),fed fat-rich diet;traditional Chinese medicine high-dose group(n=14),fed fat-rich diet;traditional Chinese medicine low-dose group(n=14),fed fat-rich diet.Four of model control group were randomly killed 8 weeks later.Low-dose group and high-dose group were fed with Chinese herbs for 8 weeks.Model group and control group were fed with isotonic Na chloride.All of the rats were weighted every week,8 weeks after treatment and all of the rats were killed.The serum levels of IL-6 and SOD were detected by ELISA method.[Results]The serum levels of IL-6 in rat of high-dose group and low-dose group showed highly significant difference compared with model group(P<0.01).The comparison between high-dose group and low-dose group showed significant difference(P<0.05). The serum levels of SOD in rats showed highly significant difference between high-dose group and model group (P<0.01)and showed significant difference between low-dose group and model group(P<0.05).The comparison of serum SOD showed no statistically significance between high-dose group and low-dose group (P>0.05).[Conclusion]Tthe traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie, Huoxue Ruanjian can significantly decrease the serum levels of IL-6,and significantly increase the serum concentrations of SOD. However,this effect does not show any dose-related trend.

nonalcoholic fatty liver disease;Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian method;interleukin-6;superoxide dismutase

R285.5

A

1672-1519（2014）10-0613-04

2014-04-22）

（本文編輯：馬 英，高 杉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.10

王 靜（1978-），女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療消化系統(tǒng)疾病。