錢(qián)煒，Bipin Kumar Rai，袁即山，劉嫣方，顧韻，陳芹，謝軍，張銘，馬永明

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中線粒體酶表達(dá)的變化

錢(qián)煒1，Bipin Kumar Rai1，袁即山2，劉嫣方3，顧韻1，陳芹3，謝軍2，張銘3，馬永明1

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．耳鼻喉科，2．骨科，3．中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討正常軟骨與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中線粒體幾種關(guān)鍵酶的表達(dá)差異。方法：收集9例骨性關(guān)節(jié)炎患者及12例正常人的軟骨，HE染色觀察軟骨的病理學(xué)表現(xiàn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RQ-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩組軟骨中NADH氧化還原酶輔酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、蘋(píng)果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表達(dá)情況。結(jié)果：骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中滑膜細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)斑片狀鈣化和纖維化。骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中NDUFA1與COX表達(dá)比正常軟骨明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；SDHB、Cytb、V-ATPase H表達(dá)比正常軟骨明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；MDH與HADHSC在兩組中表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)論：線粒體關(guān)鍵酶的變化可能在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用。

骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨；線粒體；酶

近年來(lái)骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）已逐漸成為威脅健康的疾病。骨性關(guān)節(jié)炎具有明顯的年齡相關(guān)性，隨年齡增高患病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。臨床癥狀主要包括關(guān)節(jié)疼痛、捻發(fā)音、腫脹、僵硬、疲勞及功能受限。病理主要表現(xiàn)為基質(zhì)的降解和細(xì)胞的死亡，從而逐漸破壞關(guān)節(jié)軟骨的完整性［1－4］。骨性關(guān)節(jié)炎的致病因素至今仍不明確。研究顯示線粒體可能在骨性關(guān)節(jié)炎的致病中起到重要的作用［5－6］。盡管如此，線粒體中某些重要酶的含量在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的變化仍不明確。本實(shí)驗(yàn)擬比較骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨與正常軟骨線粒體中NADH氧化還原酶輔酶1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1，NDUFA1）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）、細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）、蘋(píng)果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表達(dá)差異，探尋線粒體在骨性關(guān)節(jié)炎致病中的意義。

1 對(duì)象和方法

1．1 研究對(duì)象

收集2013年6月至2014年2月共9例骨性關(guān)節(jié)炎患者及12例正常人的軟骨。骨性關(guān)節(jié)炎軟骨來(lái)自已確診為骨性關(guān)節(jié)炎的患者（女6例，男3例，年齡55～74歲，中位69歲）進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)切除的軟骨。正常軟骨來(lái)自車(chē)禍截肢或急性關(guān)節(jié)外傷關(guān)節(jié)軟骨碎片脫落無(wú)法重新固定的患者（女8例，男4例，年齡42～82歲，中位66歲）。所有標(biāo)本來(lái)自于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院。本研究方案獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1．2 材料

兔抗人NDUFA1、SDHB抗體，HE染色試劑盒購(gòu)買(mǎi)于武漢博士德生物工程有限公司。兔抗人COX抗體購(gòu)買(mǎi)于Cell Signaling生物技術(shù)公司。兔抗人Cytb、V-ATPase H抗體，鼠抗人MDH、HADHSC、β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)買(mǎi)于Santa Cruz生物技術(shù)公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)買(mǎi)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1．3 組織固定和HE染色

新鮮軟骨用4%甲醛固定，石蠟包埋。蠟塊切成4μm切片，37℃烘箱加熱3 h，二甲苯脫蠟，蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。

1．4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

軟骨切成小塊之后加液氮研磨，加入TRIzol裂解。將2．0μg總RNA應(yīng)用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，總體系40μL，含MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U、dNTP（每種0．5 mmol／L）10 mmol／L、隨機(jī)引物10μmol／L、RNA酶抑制劑80 U，37℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，95℃5 min滅活，cDNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．5 RQ-PCR檢測(cè)軟骨線粒體酶mRNA的表達(dá)

25μL PCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液、4 mmol／L MgCl2、0．2 mmol／L dNTP、引物0．4 mmol／L、20×EvaGreen（Hayward公司，美國(guó)）1．2μL、50× ROX 0．5μL、Taq DNA聚合酶（Fermentas）1 U及cDNA 2μL。反應(yīng)在ABI 7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行，以ABL作為內(nèi)參照，2－ΔΔCT法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)含量。引物序列見(jiàn)表1。

1．6 免疫印跡檢測(cè)7種線粒體酶的表達(dá)

新鮮軟骨立即凍存在－80℃直至使用。軟骨切成小塊之后加液氮研磨，加入RIPA裂解。軟骨裂解液用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白量一致后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%BSA室溫封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（NDU-FA1 1∶100，SDHB 1∶100，Cytb 1∶200，COX 1∶1 000，V-ATPase H 1∶200，MDH 1∶200，HADHSC 1∶200，β-肌動(dòng)蛋白1∶5 000）4℃過(guò)夜。TBST洗膜之后加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，ECL顯色液化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。條帶用LAND-1D進(jìn)行灰度掃描。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果用±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，取95%可信區(qū)間。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨的病理學(xué)變化

HE染色排除正常對(duì)照組中存在含有疾病的軟骨。與正常軟骨相比，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中軟骨細(xì)胞減少、滑膜細(xì)胞增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)斑片狀鈣化和纖維化，見(jiàn)圖1。

2．2 軟骨中線粒體酶mRNA的變化

RQ-PCR檢測(cè)兩組軟骨中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中NDUFA1及COX表達(dá)比正常軟骨明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；SDHB、Cytb及V-ATPase H表達(dá)比正常軟骨明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；MDH、HADHSC在兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2．3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)軟骨中線粒體酶的變化

為了驗(yàn)證RQ-PCR的結(jié)果，我們用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步檢測(cè)軟骨中這7種酶的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常軟骨相比，NDUFA1、COX在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中明顯升高（P＜0．05或P＜0．01）；SDHB、Cytb、V-ATPase H在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中明顯下降（P＜0．05）。MDH、HADHSC在兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、圖4。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，近年來(lái)軟骨細(xì)胞線粒體在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中所起的作用越來(lái)越受到重視。一方面線粒體可以通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，另一方面又可以通過(guò)本身在細(xì)胞能量代謝中的作用介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和通過(guò)影響ATP的平衡來(lái)直接誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎的早期病損［7］。線粒體ATP的產(chǎn)生主要依靠?jī)?nèi)膜上的電子傳遞鏈完成。在線粒體呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程中，電子的化學(xué)位能被復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ利用，將基質(zhì)中的質(zhì)子泵到膜間隙中，從而將能量?jī)?chǔ)存在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)梯度中，最后質(zhì)子通過(guò)ATP酶回到基質(zhì)中，其電化學(xué)勢(shì)能被用來(lái)合成ATP分子［8－10］。呼吸鏈及最后偶聯(lián)生成ATP的過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞的能量代謝，這可能與骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退變過(guò)程相關(guān)。

研究證實(shí)軟骨細(xì)胞線粒體承擔(dān)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)并在細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化中起到重要作用。礦物沉積主要在線粒體內(nèi)的基質(zhì)囊泡內(nèi)形成，而且抑制線粒體電子傳遞鏈酶活性可以促進(jìn)基質(zhì)囊泡介導(dǎo)的軟骨鈣化［11－13］。我們通過(guò)對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)不少軟骨存在基質(zhì)鈣化，而且這些軟骨中線粒體關(guān)鍵酶發(fā)生了變化，推測(cè)這些線粒體關(guān)鍵酶數(shù)量的變化可能也與基質(zhì)鈣化相關(guān)，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

目前對(duì)于線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的變化研究較多，但是對(duì)于酶含量變化的研究較少。研究顯示，與正常軟骨相比，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的線粒體數(shù)量增多，呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ的活性明顯下降，復(fù)合體Ⅰ的活性也下降，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)合體Ⅳ的活性在兩組中無(wú)明顯差異［14］。我們通過(guò)對(duì)兩組軟骨線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶表達(dá)的比較發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中NDUFA1、COX增高，SDHB、Cytb、V-ATPase H下降，與呼吸鏈復(fù)合體的活性變化存在相同之處。在這些關(guān)鍵酶中COX是線粒體重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其含量的多少可以從側(cè)面反映線粒體的質(zhì)量，表達(dá)增高可能提示線粒體數(shù)量的增多，估計(jì)是一種補(bǔ)償線粒體呼吸鏈功能下降的代償機(jī)制。骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中SDHB、Cytb、V-ATPase H表達(dá)下降，推測(cè)這些酶表達(dá)量下降導(dǎo)致線粒體呼吸鏈酶活性降低，從而導(dǎo)致線粒體功能受損，ATP生成減少，線粒體功能的破壞使得細(xì)胞更多地依賴(lài)于糖酵解途徑供能，這就讓細(xì)胞更多地暴露于自由基的氧化損害之下，并最終被誘導(dǎo)凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ功能失調(diào)可能通過(guò)上調(diào)復(fù)合體Ⅰ這條低氧耗途徑來(lái)補(bǔ)償［15］，這可能是NDUFA1表達(dá)增高的原因之一。

基質(zhì)中MDH是一個(gè)重要的涉及糖代謝的NAD＋依賴(lài)的酶，為基質(zhì)標(biāo)志酶。關(guān)于MDH與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，與正常軟骨相比骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中MDH變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)MDH在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用并不重要。HADHSC也是線粒體的基質(zhì)酶，參與脂類(lèi)代謝，對(duì)于短鏈脂肪酸和中間產(chǎn)物的氧化至關(guān)重要。目前關(guān)于軟骨是否能利用脂肪酸進(jìn)行能量代謝的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，也許軟骨細(xì)胞能夠利用脂肪酸代謝作為能量來(lái)源，但這些成分的重要性尚無(wú)定論。本研究中骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中HADHSC與正常軟骨相比無(wú)明顯差異，提示HADHSC可能與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系并不密切。

綜上所述，NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H這些電子傳遞鏈酶在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)出現(xiàn)了明顯的改變，而MDH、HADHSC這兩種線粒體基質(zhì)酶在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)并無(wú)明顯變化，推測(cè)線粒體電子傳遞鏈關(guān)鍵酶的變化可能在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起到重要的作用。進(jìn)一步研究這些線粒體酶變化的機(jī)制，將會(huì)更為詳細(xì)地揭示線粒體酶與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病之間的關(guān)系。

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Expression of certain m itochondrion enzymes in cartilages of osteoarthritis

QIANWei1，Bipin Kumar RAI1，YUAN Ji-shan2，LIU Yan-fang3，GU Yun1，CHEN Qin3，XIE Jun2，ZHANGMing3，MA Yong-ming1
（1．Department of Otolaryngology，2．Departmentof Orthopaedics，3．Departmentof Central Laboratory，the Affiliated People’s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To compare the expressions of seven importantmitochondrion enzymes in osteoarthritis（OA）cartilages and normal cartilages．M ethods：Specimens of human articular cartilage were collected from a total of 9 osteoarthritis patients and 12 normal controls．H＆E staining showed the histologic structure of cartilage．Expressions of NDUFA1（NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha subcomplex 1），succinate dehydrogenase complex（SDHB），cytochrome b（Cytb），COX（cytochrome c oxidase），V-ATPase H（vacuolar-type H＋-ATPase），cytosolic malate dehydrogenase（MDH），hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase（HADHSC）were detected by RQ-PCR and Western-blot．Results：Compared with normal cartilage，synoviocytes proliferation and lymphocytes infiltration could be observed in osteoarthritis group．The expressions of NDUFA1 and COX increased in osteoarthritis cartilages，expressions of SDHB，Cytb，V-ATPase H decreased in osteoarthritis cartilages．The differences were statistically significant（P＜0．05）．There was no statistical significance in MDH and HADHSC expression between the two groups．Conclusion：Changes of some importantmitochondrion enzymesmay play an important role in pathopoiesis of osteoarthritis．

osteoarthritis；cartilage；mitochondrion；enzymes

錢(qián)煒（1962—），男，江蘇鎮(zhèn)江人，主任醫(yī)師，博士，主要從事耳鼻咽喉臨床和基礎(chǔ)研究。

R684．3

A

1671－7783（2014）06－0505－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140231

江蘇省“六大人才高峰”高層次人才資助項(xiàng)目（2011-WSN021D）；江蘇省醫(yī)學(xué)科研招標(biāo)立項(xiàng)課題（H201353）；鎮(zhèn)江市科技支撐社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2012042）

2014－08－19 ［編輯］何承志