郭變琴，陸蕓瑤，黃學梅（重慶市腫瘤研究所檢驗科 400032）

Wnt信號通路不僅在胚胎發(fā)育調控中起重要作用，而且它與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也息息相關，并在多種腫瘤中得到證實，是現(xiàn)今腫瘤研究的熱點。目前已發(fā)現(xiàn)，人類Wnt基因家族共有19個成員，它們編碼的產(chǎn)物均為分泌型糖蛋白，含一段信號肽及23或24個位置保守的半胱氨酸殘基［1］。Wnt2是經(jīng)典Wnt信號通路的成員之一，目前被廣泛認為是一種癌基因，該基因定位于染色體7q31.3上。近年相繼發(fā)現(xiàn)，Wnt2在某些腫瘤中表達上調，如結腸癌、胃癌、食管腺癌等［2－4］。本課題前期研究表明Wnt2在乳腺癌組織中高表達，又基于Wnt2是一種分泌型糖蛋白，作者進一步探討Wnt2在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、肝癌患者血清中的水平，為深入研究Wnt2在腫瘤中的作用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇重慶市腫瘤醫(yī)院住院的腫瘤患者77例作為研究對象，其中乳腺癌38例、卵巢癌10例、宮頸癌8例、肺癌13、肝癌8例。所有患者均為女性且均經(jīng)病理確診，所有標本除乳腺癌有2例為術后正接受化療外，其余病例均為術后復發(fā)就診患者。選擇同期在重慶市腫瘤醫(yī)院健康體檢的30例健康成年女性作對照，排除乳腺增生。所有研究對象均征得本人知情同意。

1.2 儀器與試劑人無齒型MMTV 整合位點成員酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于武漢華聯(lián)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集研究對象均于清晨空腹采集肘靜脈血，2h內分離血清，分裝后于－80℃低溫冰箱保存待檢；檢測前融解，并進一步離心，待檢。

1.3.2 檢測方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測可溶性Wnt2在血清中的水平。（1）96孔酶標反應板中，設標準品10孔（稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為6、4、2、1、0.5 ng／mL）、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔；（2）在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，37℃溫育30min，洗板5次，每次均拍干；（3）每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外，37℃溫育30min，洗板5次，每次均拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；（4）每孔加終止液50μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔吸光度（A值）；（5）以血清Wnt2標準品的A值為縱坐標（取雙復孔濃度的平均值），標準品稀釋濃度為橫坐標，繪制標準品曲線，根據(jù)標準品曲線計算出待測血清Wnt2水平。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

健康者血清中Wnt2水平為（1.23±0.69）ng／mL，乳腺癌患者為（7.22±3.26）ng／mL，卵巢癌患者為（5.55±3.89）ng／mL，宮頸癌患者（8.89±3.68）ng／mL，肝癌組患者（0.02±0.02）ng／mL，肺癌患者為（0.88±0.35）ng／mL；與健康者比較，乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌患者血清中Wnt2水平均明顯升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平無明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

Wnts是一類廣泛存在的分泌型糖蛋白，相對分子質量約40×103，通過與細胞表面、細胞外基質的聯(lián)系而體現(xiàn)信使的作用，再通過復雜的信號傳遞通路控制胚胎早期發(fā)育，決定細胞分化、細胞增殖及生長調節(jié)，而當其影響因素發(fā)生變化使其活化過度或失調時，便會導致機體發(fā)育異?；蛐纬赡[瘤［5］。目前，Wnt2被廣泛認為是一種致癌基因，然而，其在腫瘤中的作用報道不多。有研究證實，食管細胞癌中，腫瘤纖維母細胞分泌的Wnt2通過激活Wnt2－β連環(huán)蛋白信號通路，促進食管癌細胞的生長［6］；此外，Wnt2能通過自分泌或旁分泌實途徑誘導乳腺上皮細胞形態(tài)發(fā)生改變［7］；尤其是新近對Wnt2的報道引起了作者極大的興趣，麻省總醫(yī)院癌癥中心的研究人員通過芯片設備成功捕獲了人胰腺癌小鼠模型血液中的循環(huán)腫瘤細胞，并分別對胰腺循環(huán)腫瘤細胞、原發(fā)腫瘤細胞和正常胰腺組織進行了RNA 表達水平分析，結果發(fā)現(xiàn)Wnt2基因在胰腺癌中的表達量高于正常組織，尤其在循環(huán)腫瘤細胞和轉移性細胞中表達量特別高［8］。又鑒于Wnt基因編碼的產(chǎn)物為分泌型糖蛋白，并含有一段信號肽，因此作者推測Wnt2可分泌至腫瘤患者血清中。

以往研究者對Wnt2的研究主要聚焦在腫瘤組織或細胞株中，對于腫瘤患者血清中Wnt2的表達水平，尚未見研究報道。本課題組在前期對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt2高表達在乳腺癌組織上皮及間質細胞中。在本研究中，作者進一步收集了乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、肝癌的患者血清，并通過ELISA 技術檢測Wnt2在血清中的水平，與健康者比較，乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌患者血清中Wnt2水平均明顯升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平無明顯變化（P＞0.05）。由此可見，Wnt2在婦科腫瘤患者血清中的水平明顯增加。有研究也表明，BRCA1及BRCA2基因是卵巢癌的高危遺傳基因。Jazaeri［9］采用cDNA 基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA2基因的卵巢癌與Wnt2和SFRP4密切相關，該結果也間接提示了Wnt2與卵巢癌的相關性。結合本課題的實驗結果，作者推測Wnt2在婦科腫瘤的發(fā)生中可能起著重要作用，然而其在婦科腫瘤中的作用機理尚需進一步驗證。本研究中作者也發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，肝癌患者血清中Wnt2水平明顯降低。而最近文獻［10］報道，通過對一個70%肝切除的肝臟再生小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，Wnt2在觸發(fā)肝細胞的再生中起一定作用。但本研究所選肝癌病例為術后復發(fā)就診患者，因而肝臟的再生能力較健康人降低，這可能是肝癌患者血清中Wnt2水平較健康人低的原因。

此外，本課題中宮頸癌、卵巢癌、肺癌及肝癌所收集的樣本量偏小，因此本課題所得出的結果僅僅是初步的，后續(xù)尚需大樣本進一步驗證。在下一步的試驗中，作者將通過組織芯片技術，來檢測處于不同臨床分期的婦科腫瘤中Wnt2的表達情況，進一步探討Wnt2在婦科腫瘤中的作用機理，若試驗結果證實Wnt2在婦科腫瘤中的表達量與惡性程度相關，作者將在后續(xù)試驗中進一步收集不同惡性程度的婦科腫瘤患者血清，來證實Wnt2在婦科腫瘤患者血清中的表達與婦科腫瘤惡性程度是否相關，是否能作為婦科腫瘤的篩查、預后評估、預后監(jiān)測的指標而應用于臨床。

［1］Miller JR.The Wnts［J］.Genome Biol，2001，3（1）：1－15.

［2］Park JK，Song JH，He TC，et al.Overexpression of Wnt－2 in colorectal cancers［J］.Neoplasma，2009，56（2）：119－123.

［3］Cheng XX，Wang ZC，Chen XY，et al.Frequent loss of membranous E－cadherin in gastric cancers：A cross－talk with Wnt in determining the fate of beta－catenin［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22（1）：85－93.

［4］Clément G，Braunschweig R，Pasquier N，et al.Alterations of the Wnt signaling pathway during the neoplastic progression of Barrett′s esophagus［J］.Oncogene，2006，25（21）：3084－3092.

［5］Widelitz R.Wnt signaling through canonical and non－canonical pathways：recent progress［J］.Growth Factors，2005，23（2）：111－116.

［6］Fu L，Zhang C，Zhang LY，et al.Wnt2secreted by tumour fibroblasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activation of the Wnt／β－catenin signalling pathway［J］.Gut，2011，60（12）：1635－1643.

［7］Brown AM.Wnt signaling in breast cancer：have we come full circle［J］.Breast Cancer Res，2001，3（6）：351－355.

［8］Yu M，Ting DT，Stott SL，et al.RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis［J］.Nature，2012，487（748）：510－513.

［9］Jazaeri AA.Molecular profiles of hereditary epithelial ovarian cancers and their implications for the biology of this disease［J］.Mol Oncol，2009，3（2）：151－156.

［10］Ding BS，Nolan DJ，Butler JM，et al.Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration［J］.Nature，2010，468（7321）：310－315.