嚴子琴，劉麗，劉俊，施思，李海龍，蔣哲，孟凡國，周海夢，徐蓓，丁先鋒，胡衛(wèi)江，歐文斌△（.浙江清華長三角研究院／浙江省應用酶學重點實驗室／生物分析技術(shù)實驗室，浙江嘉興 4006；.中國計量科學研究院，北京 000；.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州 008）

人源甲胎蛋白（AFP）是一種腫瘤相關的單鏈糖蛋白，其糖鏈部分具有癌胚性變化的特征。AFP為胎兒時期肝臟合成的一種胚胎蛋白，出生1周后表達消失，以后完全被清蛋白所替代［1－3］。健康人不表達AFP，當患肝細胞癌、卵黃囊和胚胎樣腫瘤及部分肝外腫瘤時機體可重新合成AFP，因此臨床上AFP被當成一種肝癌及生殖細胞腫瘤的經(jīng)典血清標志物來使用，且對良惡性腫瘤的診斷、腫瘤治療的療效監(jiān)測及腫瘤預后都具有重要臨床意義［4－5］。本文從真核（畢赤酵母GS115）蛋白表達體系入手，研究人源AFP的重組克隆、異源高效表達、蛋白純化及臨床活性分析，為研制AFP標準物質(zhì)及其可溯源校準品、質(zhì)控品和體外診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和培養(yǎng)基質(zhì)粒pReceiver－AFP 由復能基因合成。質(zhì)粒pPICZαA 購自Invitrogen。DH5α、BL21（DE3）和GS115均為本實驗室保存。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。BMGY 培養(yǎng)基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×酵母無氨基氮源（YNB）10%，10×甘油10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。BMMY 培養(yǎng)基：1mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）10%，10×YNB 10%，10×甲醇10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。

1.2 肝癌血清標本選擇3例臨床肝癌患者血清標本，標為1、2、3號。1號標本為女患者的血清，年齡50歲，AFP 為281661.00ng／mL，治療期給予的抗病毒藥物為阿德福韋酯；2號標本為男患者的血清，年齡28歲，AFP 為80200.45ng／mL，治療期間未給予抗病毒藥物治療；3號標本為女患者的血清，年齡44歲，AFP為2013.18ng／mL，治療期給予的抗病毒藥物為阿德福韋酯。3例患者的肝癌類型均為巨塊型。

1.3 儀器與試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自大連寶生物公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司；增強化學發(fā)光法（ECL）免疫印跡試驗（WB）檢測試劑盒購自Millipore公司；抗His兔多抗與抗AFP 鼠單抗購自Santa Cruz Biotechnology；抗兔與抗鼠二抗均購自GE Healthcare。

1.4 構(gòu)建重組人源AFP 酵母表達載體以質(zhì)粒pReceiver－AFP為模板，上游引物CGC CGG AAT TCA TGA AGT GGG TGG AAT CAA T（含EcoRⅠ酶切識別位點），下游引物CTA GTC TAG AAA CTC CCA AAG CAG CAC GAG（含XbaⅠ酶切識別位點），聚合酶鏈反應（PCR）擴增帶雙酶切識別位點的afp目的基因片段，再將畢赤酵母表達載體pPICZαA 和afp PCR 擴增基因片段同時用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后經(jīng)T4 DNA 連接酶連接，得到重組表達質(zhì)粒pPICZαA－AFP。測序結(jié)果與GeneBank公布的AFP序列完全一致。

1.5 重組蛋白的誘導表達重組質(zhì)粒pPICZαA－AFP經(jīng)電轉(zhuǎn)化法（Bio－Rad電轉(zhuǎn)儀）轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。選取經(jīng)PCR 鑒定為陽性單克隆的4株重組菌株即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6，接種于15mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到2～6，2500r／min 離心5 min，棄上清液，用20mL BMMY 培養(yǎng)基重懸細胞，30℃振蕩培養(yǎng)甲醇（0.5%）誘導蛋白表達。誘導開始后每隔24h取樣，標本經(jīng)8000r／min離心1min，將上清液和細胞沉淀分離并放置在4℃下。同時，補加無菌的100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導。

1.6 SDS－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）及WB 將經(jīng)過處理后的蛋白進行10%SDS－PAGE，電泳完畢后1塊膠考馬斯亮藍染色，蛋白條帶通過全自動凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析。另1塊膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，抗AFP鼠單克隆一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）沖洗后加抗鼠二抗室溫孵育1h，通過ECL 用Quant LAS 4000 mini進行曝光成像［7］。將AFP 高表達菌株即UNT－AFP－4接于2L 的搖瓶中進行誘導表達。每間隔24h取樣并補加甲醇，持續(xù)誘導表達4d，將樣本處理后進行Western blot檢測分析及蛋白量測定。將第4天的發(fā)酵液離心后收集上清液，硫酸銨分級沉淀純化蛋白，HPLC 分析其純度、Western blot和電化學發(fā)光法分別檢測其免疫反應性和水平。

1.7 重組蛋白AFP的純化及測定

1.7.1 重組蛋白AFP的純化畢赤酵母GS115分泌表達的AFP不帶His標簽，用硫酸銨分級沉淀（30%、55%、75%）進行純化。

1.7.2 AFP蛋白純度水平測定純化的AFP純度用安捷倫1200HPLC儀測定。蛋白水平定值由嘉興市第一醫(yī)院羅氏E601電化學發(fā)光免疫分析儀分析測定，試劑為羅氏原裝進口。

2 結(jié)果

2.1 重組人源AFP在畢赤酵母GS115中的高表達株篩選甲醇誘導目的蛋白AFP在GS115中表達，篩選UNT－AFP（即不帶His和c－myc標簽的AFP）的高表達株。挑取4株經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆菌株，即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6分別用15mL BMMY 培養(yǎng)基進行小量搖瓶誘導表達。Western blot檢測AFP表達情況，并用電化學發(fā)光法檢測AFP水平。在70×103附近有特異性蛋白條帶，而pPICZαA／GS115陰性對照在此位置沒有條帶。進一步對重組表達的AFP 進行定量檢測，AFP 在UNT－AFP－1中水平為316.7ng／mL；在UNT－AFP－4中為402.1ng／mL；在UNT－AFP－5中為334.6ng／mL；在UNT－AFP－6中為259.7 ng／mL。其中UNT－AFP－4的表達量相對最高，因此選此菌株進行后續(xù)的蛋白表達純化。

2.2 重組人源UNT－AFP－4在畢赤酵母GS115中的大搖瓶表達及純化結(jié)果AFP能在酵母GS115中穩(wěn)定表達，發(fā)酵第4天AFP 的特異性條帶最亮，檢測其AFP 水平為102.9 ng／mL。

2.3 HPLC 分析經(jīng)硫酸銨沉淀后的AFP HPLC 圖譜上出現(xiàn)兩個峰，出現(xiàn)時間分別是2.078、2.752 min，峰面積分別是34923.9和408.5，AFP 的峰面積占總峰面積的98.844%，即經(jīng)55%硫酸銨沉淀后的AFP純度為98.844%。Western blot檢測到AFP特異性免疫反應條帶。電化學發(fā)光法檢測AFP含量分別是3473ng／mL（55%硫酸銨集份）和76.7ng／mL（75%硫酸銨集份）。據(jù)此計算，55%硫酸銨集份含有87%的AFP蛋白。

2.4 Western blot分析經(jīng)硫酸銨沉淀后的AFP 將55%硫酸銨沉淀后收集的AFP與臨床肝癌血清標本進行Western blot比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的AFP與臨床肝癌血清標本的分子大小相當，表明二者糖基化水平相近。

3 討論

目前，肝癌檢查主要包括血清AFP 和肝臟影像學檢查［6－8］。檢測AFP是當前診斷肝癌最簡便、靈敏、快捷的方法，在臨床上被認為是肝癌的經(jīng)典腫瘤標記物，因而被當作診斷肝癌的金標準［9］。

最近研究表明，AFP有其復雜的生物學功能。文獻［6］報道發(fā)現(xiàn)AFP與腫瘤細胞的惡性生長、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關，并且認為AFP是肝癌細胞耐藥的關鍵性細胞因子，研究結(jié)果顯示AFP具有潛在的抗凋亡誘導作用的生物學性質(zhì)。最新的一項研究中發(fā)現(xiàn)AFP具有抑制抑癌基因的生物學功能，導致肝癌細胞耐受全反式維A 酸誘導的凋亡。

在此研究中，作者前期也研究了AFP 在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達，與劉繼洪［4］發(fā)現(xiàn)AFP 在大腸桿菌中能表達的結(jié)果相符。但在研究重組AFP 表達的過程中，重組人源AFP在BL21（DE3）中的表達主要存在于包涵體中，必須通過變、復性才能獲得有免疫原性的目的蛋白，且經(jīng)純化得到的AFP水平只有360.2ng／mL，因此結(jié)果沒有在本文中列出。此外，原核表達獲得的AFP與人源AFP相比相對分子質(zhì)量較小，分析其原因可能與其無糖基化和蛋白折疊的差異有關。相較于此，在GS115中表達的AFP均能分泌到胞外易于目的蛋白的收集，且經(jīng)硫酸銨的初步純化后純度就可達90%以上，活力是BL21（DE3）中表達的AFP的10倍之多。此外，將GS115中表達純化后獲得的AFP與臨床肝癌血清標本進行相對分子質(zhì)量的比較，發(fā)現(xiàn)在GS115中異源表達的人源AFP相對分子質(zhì)量與肝癌血清標本相近，其糖基化水平可能相近，但確切的結(jié)論還需要進一步的研究論證。

目前，AFP主要是從嚙齒類動物胚胎和人胚胎血清中提取獲得，通過此方法獲得的AFP量少，而通過酵母表達和純化可獲得大量的且具有免疫原性的高純度AFP。當前臨床AFP檢測上，仍然呈現(xiàn)外國診斷試劑盒獨當一面的趨勢，國內(nèi)相應的體外診斷試劑盒和校準品、質(zhì)控品還相對空白。本研究可為將來制備體外診斷試劑盒、可溯源的AFP校準品、質(zhì)控品以及更多AFP新功能的進一步研究奠定基礎。

［1］Wang S，Jiang W，Chen X，et al.Alpha－fetoprotein acts as a novel signal molecule and mediates transcription of Fn14 in human hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2012，57（2）：322－329.

［2］Mizejewskia GJ，Butterstein G.Survey of functional activ－ities of alpha－fetoprotein derived growth inhibitory peptides：review and prospects［J］.Curr Protein Pept Sci，2006，7（1）：73－100.

［3］Mizejewski GJ.Therapeutic use of human alpha－fetoprotein in clinical patients：is a cancer risk involved［J］.Int J Cancer，2011，128（1）：239－242.

［4］劉繼洪.人甲胎蛋白基因原核克隆和表達［D］.杭州：浙江大學，2004.

［5］Johnson PJ.The role of serum alpha－fetoprotein estimation in the diagnosis and management of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis，2001，5（1）：145－159.

［6］Li M，Li H，Li C，et al.Alpha－fetoprotein：a new member of intracellular signal molecules in regulation of the PI3K／AKT signaling in human hepatoma cell lines［J］.Int J Cancer，2011，128（3）：524－532.

［7］陳石根，周潤琦.酶學［M］.上海：復旦大學出版社，2001.

［8］Li M，Li H，Li C，et al.Alpha fetoprotein is a novel protein－binding partner for caspase－3and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells［J］.Int J Cancer，2009，124（12）：2845－2854.

［9］Li M，Zhou S，Liu X，et al.alpha－Fetoprotein shields hepatocellular carcinoma cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand［J］.Cancer Lett，2007，249（2）：227－234.