余健　連苗軍　何正飛　陳志云

黃芪黃酮改善同型半胱氨酸誘導內(nèi)皮功能紊亂的研究

余健連苗軍何正飛陳志云

【摘要】目的觀察黃芪黃酮對同型半胱氨酸（Hcy）介導的內(nèi)皮功能紊亂的作用，并進一步探討其具體機制。 方法采用離體血管灌流技術，觀察離體血管舒張功能變化；采用離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術，測定內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的超氧陰離子和一氧化氮（NO）含量，以及一氧化氮合酶（NOS）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。 結(jié)果Hcy（10-3mol/L）可顯著抑制乙酰膽堿（Ach）介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能[舒張幅度為：（66.26±3.71）%]，黃芪黃酮（10-2，10-1，1，10g/L）則呈濃度依賴性地改善Hcy（10-3mol/L）所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能損傷 [（66.71±7.29）%，（74.67±6.64）%，（81.73±5.92）%，（85.94±5.85）%，均P＜0.01]，其作用與SOD類似，而NOS抑制劑Nω-硝基左旋精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME）可以阻斷黃芪黃酮的作用。進一步細胞實驗證實Hcy顯著抑制內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生[（7.53±1.31）vs（16.61±1.52）×10-6mol/g，P＜0.01]，抑制NOS[（3.28±0.24）vs（8.35±0.37）kU/g，P＜0.01]和SOD活性[（8.69±1.54）vs（14.74±1.57）kU/g，P＜0.01]、以及誘導超氧陰離子的生成[（179.14±14.82）%vs（100.00±8.95）%，P＜0.01]；而黃芪黃酮（1g/L）和SOD均可逆轉(zhuǎn)Hcy對內(nèi)皮的損傷作用（均P＜0.01）。 結(jié)論本研究證實黃芪黃酮通過其抗氧化作用改善同型半胱氨酸損傷的NOS－NO途徑，從而具備血管內(nèi)皮的保護功能。

【關鍵詞 】黃芪黃酮同型半胱氨酸內(nèi)皮功能

同型半胱氨酸（Hcy）是人類心血管疾病的獨立危險因子。當機體內(nèi)Hcy代謝所需的限速酶基因缺失和（或）輔因子缺乏常導致高Hcy血癥的出現(xiàn)[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，人類和動物血管接觸高濃度的Hcy后，可引起血管內(nèi)皮功能損傷，主要表現(xiàn)為一氧化氮（NO）介導的內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能減弱[2]。研究顯示，Hcy能激活促氧化酶（如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等），產(chǎn)生活性氧；后者既可以抑制NO的產(chǎn)生，又可以消耗已產(chǎn)生的NO[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠降低脂質(zhì)過氧化，促進抗氧化酶合成，具有抑制氧自由基的作用[4]。黃芪黃酮（TFA）是最主要的黃芪活性成分，具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制血管內(nèi)皮單層通透性增加等方面的藥理作用[5]。本文旨在研究TFA對Hcy誘導的內(nèi)皮功能損傷的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料和試劑浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院藥劑科負責購買中藥黃芪原料，并提取TFA，經(jīng)鑒定TFA含量為85%，并配置成10g/L溶液備用。苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（Ach）、Hcy、硝普化鈉（SNP)、Nω-硝基左旋精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME），超氧化物歧化酶（SOD）均為美國Sigma公司產(chǎn)品。蛋白濃度測定試劑盒、NO檢測試劑盒、NO合酶（NOS）活性檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒及超氧化物陰離子檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1血管環(huán)的制備由浙江省中醫(yī)學院動物所提供雄性SD大鼠，體重230～260g。大鼠均由鈍器擊暈，迅速分離出胸主動脈，置于95%O2與5%CO2預飽和的4℃K-H液（NaCl 118 mM；KCl 4.7mM；MgSO4·7H2O 1.2mM；KH2PO41.2mM；CaCl22.5mM;NaHCO325mM；葡萄糖11mM）中。剔除血管周圍結(jié)締組織，剪成3～4mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于預置10ml K-H液的浴槽內(nèi)，持續(xù)充以95%O2和5%CO2的混合氣體于37℃恒溫，血管環(huán)加靜息張力2g（由MedLab生物信號采集系統(tǒng)記錄），平衡60min。用6×10-2mol/L的KCl重復刺激3次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度。待血管環(huán)穩(wěn)定后，用10-6mol/L PE收縮血管環(huán)達峰值，加入10-5mol/L Ach檢測血管內(nèi)皮完整性。若加Ach后使PE預收縮的血管舒張在80%以上，認為內(nèi)皮完整，用于進一步實驗。

1.2.2人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)參照文獻[6]記錄分離及培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞。3～4代傳代細胞用于實驗研究。

1.2.3離體血管灌流實驗各血管環(huán)以PE（10-6mol/L）刺激引起的最大收縮幅度為標準，標記為舒張幅度100%，而后分別記錄血管環(huán)對Ach或SNP的舒張反應，所得數(shù)據(jù)用百分比表示。血管環(huán)實驗分為Hcy組、TFA組、SOD組、SOD+TFA組、L-NAME組、L-NAME+ TFA組及對照組（每組8只）。對照組僅以K-H液預孵。Hcy組血管環(huán)先用K-H液內(nèi)孵育30min，再用Hcy（0、10-5、10-4、10-3、10-2mol/L）孵育60min，而后用10-6mol/L PE收縮血管環(huán)，分別記錄血管環(huán)對Ach（10-8～10-5mol/ L）或SNP（10-8～10-5mol/L）的舒張反應。其余各組則分別先予TFA（10-2、10-1、1、10g/L）、SOD（1、2kU/L），SOD（1kU/L）+TFA（1g/L），L-NAME（10-4mol/L），L-NAME（10-4mol/L）+TFA（1g/L）預孵30min，再加入Hcy（10-3mol/ L）繼續(xù)孵育60min，后用10-6mol/L PE收縮血管環(huán)，記錄血管環(huán)對Ach（10-8～10-5mol/L）的舒張反應。

1.2.4離體培養(yǎng)內(nèi)皮細胞實驗細胞實驗分為Hcy組、TFA組、SOD組、SOD+TFA組及對照組（每組6只）。對照組僅以培養(yǎng)基液預孵。Hcy組內(nèi)皮細胞先予培養(yǎng)液預孵30min，而后用Hcy（10-3mol/L）孵育60min；其余各組內(nèi)皮細胞先予TFA（1g/L）、SOD（1.5kU/L）及SOD（1.5kU/L）+TFA（1g/L）預孵30min，而后予Hcy（10-3mol/ L）孵育60min。經(jīng)上述處理后，分別收集上清液及細胞。分別依據(jù)試劑盒說明測定NO含量、NOS和SOD活性及過氧化物陰離子。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，用Homogeneity-of-variance作方差齊性檢驗，組間比較采用方差分析及t檢驗。

2　結(jié)果

2.1離體血管實驗結(jié)果見表1～3。

由表1～3可見，Hcy（10-5、10-4、10-3、10-2mol/L）可顯著抑制Ach（1.0×10-5mol/L）介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度（均P＜0.01）。經(jīng)TFA（10-1、1、10g/L）孵育后，可濃度依賴性地改善Hcy（10-3mol/L）所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度（均P＜0.01）。采用SOD（1、2kU/ L）預孵后，也能使Hcy（10-3mol/L）損傷內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度有所恢復（均P＜0.01）。進而，用SOD（1kU/L）與TFA（1g/L）共同預孵血管后，發(fā)現(xiàn)其改善血管舒張幅度效果較其單獨預孵更為明顯（P＜0.01）。此外，由于L-NAME（10-4mol/L）的存在，TFA（1g/L）對Hcy所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度無改善作用（均P＞0.05）。

表1　Hcy對Ach介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度的影響（%）

2.2離體培養(yǎng)內(nèi)皮細胞實驗結(jié)果見表4。

表2　TFA對Hcy誘導的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度的影響（%）

表3　TFA、SOD以及L-NAME對Hcy誘導的內(nèi)皮依賴性血管舒張幅度的影響（%）

表4　離體培養(yǎng)內(nèi)皮細胞實驗結(jié)果

由表4可見，Hcy組較對照組能顯著抑制預孵的內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生、降低NOS和SOD活性并誘導超氧陰離子的生成（均P＜0.01）。TFA組則可以使超氧陰離子減少，使NOS及SOD活性恢復，從而使NO生成增加（均P＜0.01），SOD組也可以觀察到類似的效應。而TFA+SOD組對Hcy誘導的內(nèi)皮細胞功能損傷的保護作用較TFA或SOD組更為顯著（均P＜0.01）。

3　討論

本研究顯示TFA可以改善Hcy誘導的內(nèi)皮損傷。其機制可能與通過抗氧化作用改善NOS-NO途徑有關。高Hcy血癥是冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素。約40%的心腦血管及外周血管病變患者體內(nèi)Hcy水平升高。越來越多的證據(jù)表明Hcy可以破壞血管內(nèi)皮功能，進而使血管舒縮功能損傷，其具體機制為Hcy通過自身氧化作用產(chǎn)生各種氧自由基，這些產(chǎn)物對血管內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能產(chǎn)生破壞性影響；同時，Hcy可以使NOS受抑制，內(nèi)皮依賴性血管舒張因子產(chǎn)生減少，生物活性下降，使內(nèi)皮依賴性血管舒張作用受損[7]。

眾所周知，Ach通過激活內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣離子依賴的NOS催化合成NO，而SNP則是外源性NO的前體物分解生成NO。NO彌散至內(nèi)膜下的血管平滑肌，激活鳥苷環(huán)化酶，使平滑肌細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的濃度增加，從而導致血管平滑肌舒張。因此，內(nèi)皮功能紊亂主要表現(xiàn)為內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生減少及活性降低。我們的實驗證實Hcy可誘導Ach介導的血管舒張功能降低；而對SNP介導的血管舒張功能無影響。同時，Hcy還能抑制內(nèi)皮細胞NOS活性及NO的合成，因此認為，Hcy對血管的作用靶點在內(nèi)皮細胞而非平滑肌細胞，并且NOS-NO途徑可能參與了Hcy的血管損傷作用。

此外，由于巰基的存在，Hcy在金屬離子的介導下可發(fā)生自身氧化，產(chǎn)生羥自由基、過氧化氫等氧自由基，引起蛋白質(zhì)損傷，酶、受體功能障礙，以及誘導產(chǎn)生應激蛋白，清除氧自由基的酶活性降低。本研究也發(fā)現(xiàn)Hcy能顯著增加培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞內(nèi)超氧陰離子含量，并抑制SOD活性。既往研究認為，超氧自由基清除因子——SOD是有效的血管保護劑，它對損傷的主動脈、肺動脈、骨骼肌動脈等均有保護作用[8]，本研究中采用抗氧化物酶SOD也顯著逆轉(zhuǎn)了Hcy誘導的血管功能損傷。

近年來，具有抗氧化作用的植物類藥物引起了眾多的關注。傳統(tǒng)中藥黃芪因具有抗氧化活性，迄今已被廣泛應用于防止各種病理狀態(tài)下氧自由基介導損傷。體外研究證實，黃芪通過二甲基亞砜系統(tǒng)能抑制活性氧族產(chǎn)生，清除率超過90%；而且黃芪抗氧化活性還能顯著改善胰腺β細胞功能；有效地抑制牛的肝、腎勻漿自發(fā)性或H2O2誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用[9]。藥理研究證實中藥黃芪是一復合物，其成分主要含有TFA、皂甙及多糖等。多種研究證實TFA具有很強的抗氧化作用：它可以直接超氧陰離子、羥自由基、脂質(zhì)過氧化物等活性氧自由基；抑制細胞膜、DNA等的氧化損傷；防止心肌缺血再灌注后自由基形成[10]。我們的研究顯示，TFA可以改善Hcy誘導的內(nèi)皮依賴性舒張功能紊亂，該作用可以被NOS抑制劑——L-NAME所阻斷。同時，體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞研究發(fā)現(xiàn)TFA也能使經(jīng)Hcy預孵的內(nèi)皮細胞合成NO含量增加及NOS酶活性增高。進而，我們通過TFA處理Hcy孵育的內(nèi)皮細胞，還能使SOD活性增加，而氧自由基合成減少，后者效果類似于SOD的作用。

總之，本研究證實TFA通過其抗氧化作用改善Hcy損傷的NOS-NO途徑，從而具備血管內(nèi)皮的保護功能。這一結(jié)果為高Hcy血癥患者病變血管的治療提供了全新的方案。

4　參考文獻

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（本文編輯：馬雯娜）

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本刊編輯部

收稿日期：（2013-03-22）

作者單位：310003杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（余健、連苗軍，余健系富陽市人民醫(yī)院進修醫(yī)師）；富陽市人民醫(yī)院心內(nèi)科（何正飛、陳志云）

Astragalus flavonoids attenuates endothelial dysfunction induced by homocysteine

YU Jian,LIAN Miaojun,HE Zhengfei,et al.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310006,China

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of Astragalus flavonoids on endothelial dysfunction induced by homocysteine(Hcy)and the underlying mechanism.MethodsThe vasorelaxation response of aortic ring of rats was determined by isometric tension recordings.The levels of reactive oxygen species and nitric oxide and the activities of nitric oxide synthase and superoxide dismutase in human umbilical vein endothelial cells were measured.ResultsHcy significantly inhibited acetylcholine-induced endothelium-dependent relaxation.In a concentration-dependent manner,the treatment with Astragalus flavonoids showed the same effect as the superoxide dismutase on improving the endothelial function,which was blocked by Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride.Moreover,in cultured human umbilical vein endothelial cells,homocysteine markedly reduced the levels of reactive oxygen species and nitric oxide,and inhibited the activities of nitric oxide synthase and superoxide dismutase,both of which were reversed completely by Astragalus flavonoids.ConclusionThese data support the view that Astragalus flavonoids can improve the endothelial dysfunction induced by injured nitric oxide-nitric oxide synthase pathway due to oxidative stress in hyperhomocysteinemia.

【Key words】Astragalus flavonoidsHomocysteineEndothelial function