邢大偉 張鑫 楊鵬麟

miRNA-34a對無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

邢大偉 張鑫 楊鵬麟

目的 探討miRNA-34a（miR-34a）對無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）表達(dá)水平的影響。方法 體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2，實驗分實驗組（轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor）、空白對照組（無轉(zhuǎn)染miR inhibitor）和陰性對照組（轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成NC microRNA片段）。轉(zhuǎn)染24h后無血清培養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Western bolt法檢測Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 實驗組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)低于空白對照組和陰性對照組（P＜0．05）。Bcl-2表達(dá)明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0．05）。結(jié)論 轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor可以下調(diào)miR-34a的表達(dá)，減少無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的凋亡，Bcl-2的表達(dá)增加可能參與了其保護(hù)機(jī)制。

H9C2 miRNA-34a 凋亡 Bcl-2

miRNA是一類內(nèi)源性短鏈非編碼小分子RNA，長約21～25個核苷酸，通過其5＇端第2～8位核苷酸與靶基因mRNA的3＇URT互不配對實現(xiàn)了對靶基因的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。至今已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的miRNA超過1 000種。近年來大量研究證實miRNA參與許多細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，包括增殖、凋亡、發(fā)育、分化及代謝等。目前冠心病作為一種中老年人群中常見病，發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響人類的健康。大量動物實驗證實無論是急性冠狀動脈綜合征還是隱匿性心肌缺血均對心肌造成嚴(yán)重?fù)p傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及壞死[1-3]。本實驗體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2，無血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡體外模擬心肌缺血狀態(tài)，通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a的表達(dá)，觀察其是否對饑餓誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 大鼠胚胎心肌細(xì)胞株H9C2（2-1）購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM、0.05%胰酶/EDTA、FBS、Hanks balanced salt solution均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol、DEPC水均購自美國Invitrogen公司；RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司；miScript Reverse Transcription Kit購自德國Qiagen公司；PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix），96孔板及封板膜均購自美國ABI公司；RIPA、PMSF和SDS-PAGE制膠試劑盒均購自江蘇碧云天試劑公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；Caspase-3抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體和羊抗兔抗體均購自香港Abcam公司；電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞株在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 miR-34a inhibitor片段的合成 由上海吉瑪公司設(shè)計并合成。miR-34a inhibitor序列：5＇-ACCGUCACAGAAUCGACCAACA-3＇，miR-34a inhibitor陰性對照序列（NCmicroRNA）：5＇-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3＇，與大鼠基因組各基因均無顯著同源性。

1.2.3 實驗分組 H9C2細(xì)胞接種到6孔板，以每孔5μl的FAM-miRNA和5μl的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染6孔板中H9C2細(xì)胞，分為實驗組（轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor）、空白對照組（無轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成NC microRNA片段）。轉(zhuǎn)染24 h后再用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果 各組細(xì)胞以1× 105/孔的密度接種至6孔板中，轉(zhuǎn)染后24h后，Trizol提取各孔中細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀和甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢總RNA的純度和質(zhì)量，取100 ng總RNA，應(yīng)用miRNA Isolation Kit試劑盒分離小分子RNA，應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再應(yīng)用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR檢測各組中miR-34a的含量。PCR條件：95℃5 s，60℃34s，共40個循環(huán)。采用U6 RNA作為內(nèi)參，計算方法采用ΔΔCt（Ct表示PCR擴(kuò)增過程中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)），miR-34a的ΔCtsample=Ct sample-Ct/U6sample，ΔCt control=Ct control-Ct U6 control，ΔΔCt=ΔCt sample-ΔCt control）

1.2.5 Western Bolt法檢測Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)饑餓誘導(dǎo)凋亡24 h后，裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1）裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，100℃5min使蛋白變性，各組蛋白上樣量30μg，于12%SDS-PAGE膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗（Caspase-3 antibody 1∶800，Bcl-2 antibody 1∶500）4℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜。二抗羊抗兔IgG抗體（1∶4 000）室溫孵育2h，洗膜，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描條帶，以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化Caspase-3、Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)，用Alpha-EaseFC凝膠成像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染效果 H9C2細(xì)胞miRNA-34a表達(dá)水平空白對照組為1.00±0.00，陰性對照組為0.95±0.12，均高于實驗組的0.13±0.03（均P＜0.05）。2.2 Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)水平 Caspase-3表達(dá)水平實驗組（0.65±0.09）較空白對照組（1.00±0.00）和陰性對照組（1.02±0.10）降低（均P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Bcl-2表達(dá)水平在實驗組（1.43±0.07）較空白對照組（1.00±0.00）和陰性對照組（0.96±0.11）升高（均P＜0.05），后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)水平見圖1。

圖1 Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)水平（BC：空白對照組；NC：陰性對照組；MI：實驗組）

3 討論

MiRNA-34基因家族幾乎在所有的脊椎動物中均有表達(dá)，目前已經(jīng)明確該基因在哺乳動物早期發(fā)育中起重要調(diào)控作用[4]。研究報道m(xù)iRNA-34家族對腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。Corney等[6]研究發(fā)現(xiàn)人卵巢癌miRNA-34家族表達(dá)降低，癌細(xì)胞凋亡率減少，這可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Boon等[7]近期發(fā)表在Natrure雜志上的論文表明，在老年人以及老年小鼠的心臟組織中miR-34a表達(dá)上調(diào)，老年機(jī)體心肌細(xì)胞凋亡水平明顯增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在Ku80基因敲除純合子小鼠中，miR-34a表達(dá)上調(diào)，而Ku80基因在DNA修復(fù)及細(xì)胞凋亡方面起重要的調(diào)節(jié)作用，Ku80基因敲除小鼠易發(fā)生腫瘤或早熟[8-9]。以上研究都表明miR-34a具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

本實驗通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-34a水平，再用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，饑餓誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-34a能減少Caspase-3的表達(dá)。細(xì)胞凋亡過程是由至少3個具有獨特功能的階段組成：細(xì)胞接受死亡刺激的起始階段；依賴于Bcl-2家族的致凋亡蛋白（如細(xì)胞色素C）自線粒體釋放的效應(yīng)階段；以及依賴于Caspases的降解階段，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行蛋白，是最主要的終末剪切酶，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性能反映細(xì)胞凋亡水平的高低[10]。故我們推測miR-34a表達(dá)下調(diào)對饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

通過targetscan、pictar及miRbase 3個miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站得知Bcl-2是miR-34a候選靶基因之一，其5＇端1～7位堿基與Bcl-2mRNA終止子后189～195位堿基完全互補(bǔ)配對。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員之一，是重要的抗凋亡蛋白。Vander Heiden等[11]研究報道，Bcl-2具有減輕線粒體膜間隙過酸從而抑制細(xì)胞色素C釋放，而后者的釋放將激活Caspase-9和Caspase-3從而引發(fā)凋亡聯(lián)級反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本實驗轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a水平，發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)升高，故我們推測Bcl-2可能是miR-34a的靶基因。Bcl-2表達(dá)增加抑制細(xì)胞色素C釋放，使得Caspase-3活性降低，從而對饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷起到了保護(hù)作用。

綜上所述，本研究利用無血清饑餓培養(yǎng)心肌細(xì)胞體外模擬心肌缺血狀態(tài)，初步表面抑制了miR-34a的表達(dá)，可減少心肌細(xì)胞凋亡，miR-34a可能是冠心病治療的重要靶點，針對miR-34a開發(fā)治療冠心病藥物具有臨床前景。

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Effect of miRNA-34a on serum-free-induced apoptosis in cardiomyocytes and its mechanism

Objective To investigate the effect of microRNA-34a (miR-34a)on serum-free-induced apoptosis in cardiomyocytes and its mechanism．Methods Rat cardiomyocytes H9C2 were cultured in vitro and divided into three groups:in experimental group H9C2 cells were transfected with miR-34a inhibitor,blank control group had no transfection,in negative control group cells were transfected with randomly synthesised miRNA．H9C2 cells were cultured in serum-free medium to induce apoptosis after transfection．Western blot was preformed to examine the expression of Caspase-3 and Bcl-2 protein．Results Western blot showed that compared with blank control and negative control groups,the expression of Caspase-3 was significantly decreased in experimental group(P＜0．05),while the expression of Bcl-2 was significantly increased in the experimental group(P＜0．05)．Conclusion Transfection of miR-34a inhibitor down-regulates miR-34a expression,and inhibites serum-freeinduced apoptosis in H9C2 cells,which is associated with the up-regulation of Bcl-2．

H9C2 miRNA-34a Apoptosis Bcl-2

2014-03-04）

（本文編輯：楊麗）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科通信作者：楊鵬麟，E-mail：yangpengling@163.com