駱高江 方明 姜昌浩

雷帕霉素對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響

駱高江 方明 姜昌浩

目的 研究雷帕霉素對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)免疫功能的影響。方法 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,在含粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、IL-4、胎牛血清及有或無(wú)雷帕霉素的培養(yǎng)條件下制備DC。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表型（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測(cè)DC對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的刺激能力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC吞噬功能和凋亡細(xì)胞數(shù)；ELISA法測(cè)定MLR上清液中的細(xì)胞因子。結(jié)果 與對(duì)照組比較,經(jīng)雷帕霉素處理的DC表面CD1a、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)明顯降低（均P＜0．01）；對(duì)T淋巴細(xì)胞刺激的能力下降（P＜0．01）；細(xì)胞吞噬能力下降（P＜0．01）；凋亡細(xì)胞數(shù)增加（P＜0．01），MLR中細(xì)胞因子（TNF-α、IL-10、IL-12）濃度降低（均P＜0．01）。結(jié)論 雷帕霉素對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能有明顯的抑制作用,可能是其防止冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄的機(jī)制之一。

雷帕霉素 樹(shù)突狀細(xì)胞 免疫功能

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，炎癥和免疫是致AS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）被發(fā)現(xiàn)存在于正常動(dòng)脈壁中，而在粥樣斑塊中數(shù)量明顯增多，說(shuō)明DC可能在致AS的炎癥反應(yīng)中起重要作用[1]。多項(xiàng)研究表明DC是體內(nèi)最具潛能的抗原遞層細(xì)胞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)中起決定性作用[2]。本研究通過(guò)雷帕霉素對(duì)人單核細(xì)胞源DC的表面標(biāo)志物、成熟和抗原遞呈功能、分泌細(xì)胞因子、凋亡的影響，探討雷帕霉素對(duì)人單核細(xì)胞源DC的分化、成熟及其免疫功能的影響，進(jìn)一步研究雷帕霉素在AS免疫炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑 健康志愿者的血白細(xì)胞懸液由義烏市血液中心提供，用于分離培養(yǎng)人外周血DC和T淋巴細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma）,倒置顯微鏡（Olympus BX 50）,常溫離心機(jī)Anke TGC-16B（上海安亭科學(xué)儀器廠）,-70℃、-20℃低溫冰箱（日本SANYO公司），24孔和6孔培養(yǎng)板（美國(guó)Coring公司），流式細(xì)胞儀及軟件。雷帕霉素100mg（美國(guó)ALEXIS BIOCHEMICALS公司），人重組腫瘤壞死因子-α（rhTNF-α，美國(guó)Pepretech公司），胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclone公司），脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司），人重組集落刺激因子、人重組白介素-4（rhGM-CSF、rhIL-4，美國(guó)R&D公司）,RPMI 1640培養(yǎng)基、人類(lèi)白細(xì)胞抗原熒光標(biāo)記抗體（HLA-DR-FITC）、CD83熒光標(biāo)記抗體（CD83-FITC）、CD83熒光標(biāo)記抗體（CD83-FITC）、CD1a熒光標(biāo)記抗體（CD1a-FITC）（美國(guó)Caltag公司）,絲裂霉素C（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）,人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?二甲基亞砜（DMSO,Amresco Inc公司原產(chǎn)、上海生工生物工程有限公司分裝），5×RT碘化丙啶緩沖液（上海生工生物工程公司）；rhIL-12、rhIL-10、TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國(guó)Biosource公司）。

1.2 方法[3]

1.2.1 DC的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)血液樣本來(lái)自9位健康志愿者，每份血液完成一組實(shí)驗(yàn)，包括imDC對(duì)照組、mDC組和3個(gè)濃度梯度雷帕霉素干預(yù)組的DC免疫功能檢測(cè)。取新鮮分離的健康成人外周血白細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液收集單個(gè)核細(xì)胞，再用CD14+磁珠分選出純度＞98%的CD14+單核細(xì)胞,種于含rhGM-CSF（20ng/ml）、rhIL-4（2ng/ml）、15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI1640中，隔天半量換液，第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC（imDC），加100 ng/ml的脂多糖（LPS）繼續(xù)培養(yǎng)2d收集起來(lái)作為成熟DC（mDC）。培養(yǎng)第7天在電子顯微鏡下觀察DC的形態(tài)。

1.2.2 DC的免疫功能檢測(cè) 分別用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素和100 ng/ml的LPS加入DC作用24h，同時(shí)以只加完全培養(yǎng)基的細(xì)胞做對(duì)照。然后分別做以下實(shí)驗(yàn)：（1）DC的促淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）：濃度為2×105/ml的淋巴細(xì)胞與濃度為2×104/ml的DC在96孔平底培養(yǎng)板中37℃,5%CO2條件下混合培養(yǎng)5 d。5 d后取上清液,-20℃保存待測(cè)細(xì)胞因子;沉淀細(xì)胞加MTT液（25孔）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加DMSO 100μl,波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度（A值）；ELISA法檢測(cè)上述培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12、TNF-a的含量。（2）DC的表型檢測(cè)：收集干預(yù)24h的細(xì)胞分別加入單克隆抗人抗體CD1a、CD83、CD86、HLA-DR,孵育30 min,PBS洗2遍,加入FITC熒光標(biāo)的二抗,孵育20 min,PBS洗2遍后懸于熒光標(biāo)記液中,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)數(shù)據(jù)。（3）DC的吞噬功能檢測(cè)：收集干預(yù)24h的DC，加入1mg/ml的FITC-Dextran在4℃（陰性對(duì)照）或37℃孵育30 min，用含5%FBS的PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用200μl的PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值。（4）DC的凋亡檢測(cè):收集干預(yù)24h的DC，重懸于500μl的Binding Buffer,再加入5μl Annexin-FITC和5μl Propidium Iodide充分混勻避光，反應(yīng)10min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析（ANOVA）,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DC形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 可見(jiàn)細(xì)胞聚集成簇，細(xì)胞表面大量皺褶和樹(shù)枝狀突起，胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，為典型的DC細(xì)胞（圖1）。

圖1 樹(shù)突狀細(xì)胞聚集成簇（×40）

2.2 各組細(xì)胞表面分子表達(dá)情況 見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞表面分子表達(dá)陽(yáng)性率情況（%）

由表 1可見(jiàn)，mDC組表面 CD1a、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)較imDC明顯升高（均P＜0.01）；雷帕霉素干預(yù)后，imDC細(xì)胞表面分子CD1a、CD83、CD86、HLA-DR表達(dá)明顯下降（均P＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)結(jié)果 FITC-Dextran陽(yáng)性率imDC（4℃）組（3.35±0.31）%，imDC（37℃）組（59.76± 9.92）%，mDC組（17.62±2.68）%，雷帕霉素1.0μg/ml組（34.13±3.86）%，0.5μg/ml組（32.20±3.74）%，0.1μg/ml組（31.07±3.25）%。mDC吞噬能力較imDC明顯下降（P＜0.01）；用雷帕霉素干預(yù)后，imDC的細(xì)胞吞噬能力明顯降低（均P＜0.01）。

2.4 細(xì)胞因子定量檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，mDC組分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α明顯高于imDC組（均P＜0.01）；用雷帕霉素干預(yù)后，IL-10、IL-12和TNF-α明顯低于對(duì)照組（均P＜0.01）。2.5MLR imDC組和mDC組A值分別為（3.96±0.75）%和（5.78±1.16）%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示mDC刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力明顯強(qiáng)于imDC；用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素干預(yù)后，A值分別為：（1.24±0.36）%、（1.30±0.34）%、（1.47±0.39）%，均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.01），說(shuō)明雷帕霉素可以明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

表2 細(xì)胞因子定量檢測(cè)結(jié)果（pg/ml）

2.6 雷帕霉素誘導(dǎo)DC凋亡情況 imDC組和mDC組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為（7.42±0.91）%和（97.68±0.95）%；用1.0、0.5、0.1μg/ml的雷帕霉素干預(yù)后，凋亡的細(xì)胞數(shù)分別為：（12.43±1.76）%、（12.60±1.59）%、（11.75±1.26）%，均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），提示雷帕霉素可以誘導(dǎo)imDC凋亡，mDC與imDC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

有關(guān)AS發(fā)病機(jī)制研究的主要理論有“損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)”，“脂蛋白改變反應(yīng)學(xué)說(shuō)”，以及近年來(lái)的“免疫反應(yīng)假說(shuō)”等[4-6]。雖然AS的具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但近來(lái)認(rèn)為，AS發(fā)生的最初是一種免疫炎癥性反應(yīng)[7-8]，在血液循環(huán)中各種刺激物質(zhì)的作用下，人血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)多種促炎癥分子，如IL-6、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化因子-B（TGF-B）和TNF-α，這些因子在AS發(fā)生過(guò)程中起了重要作用[9]。

1995年DC被發(fā)現(xiàn)存在于動(dòng)脈壁中[10]，之后越來(lái)越多的研究表明DC在AS的發(fā)生、發(fā)展中亦具有重要作用。1997年，Wick等[11]提出了關(guān)于AS炎癥機(jī)制的全新假說(shuō)——血管相關(guān)性淋巴樣組織（VALT）學(xué)說(shuō)：由DC、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的聚集物組成，沿血管腔分布于動(dòng)脈內(nèi)膜的內(nèi)皮下層，是血管組織的屏障，當(dāng)有害抗原激活VALT，既而誘發(fā)局部血管壁免疫炎癥反應(yīng)，最終將導(dǎo)致AS的發(fā)生。又有研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者外周血中骨髓來(lái)源的DC數(shù)量明顯減少，而在AS斑塊中DC的數(shù)量較正常血管壁中明顯增加，尤其是在炎癥浸潤(rùn)區(qū)域與T淋巴細(xì)胞聚集在一起[12]，提示DC遷移進(jìn)入局部病變血管壁，既而提呈抗原，激活T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)免疫炎癥反應(yīng)。免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生和放大需要抗原遞呈，而DC是體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞。外周血單核細(xì)胞是其重要來(lái)源之一，在rhGM2CSF和rh IL-24誘導(dǎo)下可分化為未成熟DC，此階段它具有較強(qiáng)的內(nèi)吞、處理抗原的能力，但細(xì)胞表面缺乏協(xié)同刺激分子，MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)很低，激發(fā)同種T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較弱；當(dāng)接受抗原刺激而促使其進(jìn)一步分化成熟，此時(shí)其細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD86上調(diào)，激活T淋巴細(xì)胞能力明顯增強(qiáng)，參與特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致AS發(fā)生、發(fā)展。

藥物涂層支架用于心臟疾病的臨床治療，是心臟介人治療領(lǐng)域的一個(gè)飛躍。藥物涂層支架通過(guò)持續(xù)地向靶標(biāo)血管壁的平滑肌細(xì)胞釋放抗狹窄藥物，抑制血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增生，預(yù)防了支架內(nèi)再狹窄的形成。涂層支架藥物釋放的靶向性特點(diǎn)也增加了局部損傷血管處的給藥濃度，減少了全身性藥物毒性，較全身給藥預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的效果理想[13]。目前，雷帕霉素藥物涂層支架在全世界廣泛使用[14]。雷帕霉素與細(xì)胞內(nèi)受體FKBP12結(jié)合后，作用于靶蛋白mTOR,最終抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（CDKI）家族中p27Kip1的降解。p27Kip1在血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其濃度的增加抑制了細(xì)胞進(jìn)人S期所必需的pRb（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋自）磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致G1期-S期的細(xì)胞周期停滯，抑制了平滑肌細(xì)胞的增生以及細(xì)胞從平滑肌中層向內(nèi)膜的遷移過(guò)程[15]。到目前為止，大多數(shù)的研究主要關(guān)注雷帕霉素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的抑制作用，但是，很少有人關(guān)注雷帕霉素對(duì)免疫炎性細(xì)胞的直接作用，尤其是對(duì)DC的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查找國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)，雷帕霉素取1.0、0.5、0.1μg/ml 3個(gè)濃度[16]，采取干預(yù)imDC，用不加藥物的imDC作為空白對(duì)照，同時(shí)添加100 ng/ml LPS后培養(yǎng)為成熟DC亦進(jìn)行比較。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后的imDC細(xì)胞表面分子CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達(dá)明顯下降，不同濃度的雷帕霉素干預(yù)后，CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明雷帕霉素能夠抑制DC的分化和成熟，但無(wú)濃度梯度差異。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC吞噬Dextran的濃度，經(jīng)LPS干預(yù)DC的吞噬能力明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明成熟DC的吞噬能力較未成熟DC降低；用雷帕霉素干預(yù)imDC，細(xì)胞的吞噬能力均明顯下降，但沒(méi)有隨著濃度的增加而吞噬能力下降，說(shuō)明雷帕霉素能夠抑制DC的吞噬功能，而抑制DC吞噬功能無(wú)濃度相關(guān)。ELISA法細(xì)胞因子定量檢測(cè)表明，成熟DC分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α能力較未成熟DC強(qiáng)，而雷帕霉素能夠抑制imDC分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α。用MTT法檢測(cè)MLR，mDC可以產(chǎn)生與對(duì)照組有差異的MLR，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)的imDC可以產(chǎn)生與對(duì)照組有差異的MLR，說(shuō)明mDC使T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)加強(qiáng)，而雷帕霉素可以使DC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)下降[17]。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC凋亡，雷帕霉素可以誘導(dǎo)imDC凋亡，但無(wú)明顯濃度差異，mDC和imDC比較，無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)雷帕霉素僅選了3個(gè)濃度，而且藥物作用只選了24h，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能代表雷帕霉素作用24h的結(jié)果，具體48、72h甚至更久時(shí)間作用的結(jié)果待以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確，同時(shí)應(yīng)增加濃度梯度使實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步完善。

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Effects of rapamycin on immune function of human monocyte-derived dendritic cells

Objective To investigate the effects of rapamycin on immune function of human monocyte-derived dendritic cells(DC)． Methods Human monocytes were isolated and cultured with fetal bovine serum,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF)and interleukin-4(rhIL-4)with or without rapamycin．Allogeneic T cell activation by DCs was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR)．ELISA was used to detect the expression of IL-10,IL-12 and TNF-α．The immunophenotype,cell apoptosis and endocytic activity of DCs were measured by flow cytometry． Results The level of CD1a, CD83,CD86 and HLA-DR in rapamycin treatment group was lower than those in control group(P＜0．01)．Rapamycin inhibited the endocytic and T-cell stimulating activity of DCs(P＜0．01),induced DC apoptosis,and decreased the secretion of IL-10,IL-12 and TNF-a(P＜0．01)．Conclusion Rapamycin can inhibit the immune function of human monocyte-derived dendritic cells,which may be one of the mechanisms for prevention of in-stent restenosis．

Rapamycin Dendritic cells Immune function

2014-01-09）

（本文編輯：馬雯娜）

義烏市科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：12-3-26）作者單位：322000 義烏市中心醫(yī)院心內(nèi)科

駱高江,E-mail:luogaojiang@sohu.com