蔣鳳春 季亢挺 隋向前 唐疾飛

苯并[a]芘誘導(dǎo)小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成機(jī)制研究

蔣鳳春 季亢挺 隋向前 唐疾飛

目的 探討香煙煙霧重要成分苯并[a]芘（BaP）誘導(dǎo)小鼠腹主動(dòng)脈瘤（AAA）形成的相關(guān)機(jī)制。方法 48只7～9月齡C57BL/6N小鼠分為對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）組、BaP組、AngⅡ/BaP復(fù)合物組。5周后取各組小鼠腹主動(dòng)脈觀察大體標(biāo)本形態(tài),切片行HE染色觀察血管結(jié)構(gòu)；免疫組化法檢測(cè)各組靶血管基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、核轉(zhuǎn)錄因子-κappaB（NF-κB）的表達(dá), POD法TUNEL檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 大體標(biāo)本顯示AngⅡ/BaP復(fù)合物組腹主動(dòng)脈瘤形成率為41．67%，明顯高于AngⅡ組腹主動(dòng)脈瘤形成率25．00%（P＜0．05），HE染色提示動(dòng)脈瘤形成處彈性纖維紊亂血管壁顯著變薄。免疫組化提示AngⅡ/BaP復(fù)合物組MMP-3及NF-κB的表達(dá)均較AngⅡ組及BaP組增加 [（0．48±0．13）%vs（0．24±0．16）%，（0．34±0．10）%；（0．42± 0．12）%vs（0．23±0．06）%，（0．32±0．09）%，均P＜0．05]。AngⅡ/BaP復(fù)合物組平滑肌細(xì)胞凋亡較AngⅡ組及BaP組更明顯[（30± 12）%vs（19±5）%，（23±4）%，均P＜0．05]。結(jié)論 BaP在AngⅡ協(xié)同作用下可促進(jìn)老齡C57BL/6N小鼠形成AAA，其機(jī)制可能與BaP通過NF-κB促進(jìn)MMP-3的表達(dá)使彈性纖維紊亂及平滑肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

苯并[a]芘 腹主動(dòng)脈瘤 基質(zhì)金屬蛋白酶-3 核轉(zhuǎn)錄因子-κappaB 平滑肌細(xì)胞

多環(huán)芳烴是含有2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)的芳香族化合物，該類物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，分布廣泛，其中香煙煙霧的重要成分之一苯并[a]芘（BaP）就是多環(huán)芳烴的代表物質(zhì)。有研究證實(shí)每天吸1包無(wú)過濾嘴香煙或過濾嘴香煙，人體分別吸收700ng或400ng的BaP即相當(dāng)于6～10μg的多環(huán)芳烴。已知吸煙是腹主動(dòng)脈瘤（AAA）的誘發(fā)因素之一[1-2]，且在眾多香煙煙霧的成分中，BaP可引起血管壁的病理學(xué)改變[3-4]，并可導(dǎo)致血管組織中核轉(zhuǎn)錄因子κappaB（NF-κB）激活[5]、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）表達(dá)上升、平滑肌細(xì)胞凋亡等改變，且類似的改變也可在人類AAA中觀察到，由此我們推測(cè)BaP對(duì)AAA形成可能有促進(jìn)作用。鑒于國(guó)內(nèi)吸煙人口眾多且AAA發(fā)病率不斷上升，而AAA的防治措施缺乏。本實(shí)驗(yàn)研究BaP對(duì)AAA發(fā)生、發(fā)展的影響，為AAA的預(yù)防及治療提供策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 雄性SPF級(jí)C57BL/6N小鼠，7～9月齡，體重35～40g；購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。單籠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院科研中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房；飲用純凈水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食；生活節(jié)律為晝夜12h，保持恒溫恒濕。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）-A9525，BaP-B1760均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；中鏈甘油三酯-WL1349，購(gòu)自法國(guó)嘉法獅公司，其對(duì)機(jī)體無(wú)害，在實(shí)驗(yàn)中作為BaP的溶劑；藥物微量滲透泵（Osmotic Pump，Model 2004；0.25μl/h，4W）為美國(guó)Alzet公司生產(chǎn)。NF-κB、MMP-3試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。POD法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 采用完全隨機(jī)分組法將小鼠分為4組，對(duì)照組、AngⅡ組、BaP組和AngⅡ/BaP復(fù)合物組，每組12只。對(duì)照組：腹腔注射中鏈甘油三酯5ml/kg，1次/周；AngⅡ組：2%戊巴比妥鈉40mg/kg，腹腔注射麻醉，俯臥位固定，背部肩胛處備皮、消毒，作長(zhǎng)約1cm切口，皮下埋置AngⅡ微量緩釋泵（AngⅡ溶于無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，每只泵均注入168μl的AngⅡ溶液,放置于37℃水浴箱中12h備用，藥物緩釋泵持續(xù)釋放AngⅡ0.72mg/（kg·d），釋放速度0.25μl/h，持續(xù)4周），同時(shí)腹腔注射中鏈甘油三酯5ml/kg，1次/周；BaP組：以10mg/ kg的劑量溶解于中鏈甘油三酯配制成2mg/ml的溶液，每周5ml/kg，進(jìn)行腹腔注射；AngⅡ/BaP復(fù)合物組：背部植入AngⅡ滲透泵，同時(shí)腹腔注射溶解于中鏈甘油三酯的BaP，5ml/kg，1次/周，劑量及方法同前。

1.2.2 病理標(biāo)本取材和制作 （1）給藥5周后，小鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后仰臥位固定，打開胸腹腔，暴露心臟行0.9%氯化鈉溶液心臟灌注，待肺組織呈白色后繼續(xù)4%多聚甲醛灌注15min，在解剖顯微鏡下分離腹主動(dòng)脈，取出腹主動(dòng)脈后拍照。取靶血管置于10%的甲醛溶液中繼續(xù)固定24h。（2）梯度乙醇脫水，包埋，間斷切片，切片厚度4μm，行HE染色觀察血管形態(tài)，應(yīng)用ImageJ專業(yè)分析軟件測(cè)血管周長(zhǎng)。取每只小鼠腹主動(dòng)脈12個(gè)不同橫截面進(jìn)行測(cè)量，測(cè)得單只小鼠腹主動(dòng)脈平均周長(zhǎng)，并以此計(jì)算各組小鼠腹主動(dòng)脈平均周長(zhǎng)；如各處理組內(nèi)有小鼠腹主動(dòng)脈最大周長(zhǎng)大于對(duì)照組平均血管周長(zhǎng)的50%，視為腹主動(dòng)脈瘤形成。

1.2.3 免疫組化測(cè)定 以抗MMP-3抗體、單克隆抗NF-κB抗體行免疫組化染色評(píng)估MMP-3、NF-κB在AAA大動(dòng)脈壁的激活及表達(dá)。具體方法：取血管標(biāo)本石蠟包埋，切片，采用免疫組化SP法，常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗4℃過夜、加生物素化二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、透明、封片。采用IPP軟件分析：每個(gè)標(biāo)本取3張切片，每張切片取5個(gè)視野,分別計(jì)算陽(yáng)性染色面積、有效統(tǒng)計(jì)面積,以陽(yáng)性染色面積在有效統(tǒng)計(jì)面積所占的百分比為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)MMP-3及NF-κB的表達(dá),取平均值，并以此計(jì)算各組MMP-3及NF-κB的表達(dá)。

1.2.4 POD法檢測(cè)TUNEL細(xì)胞凋亡 腹主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟至水，PBS洗滌5min×2次，用蛋白酶細(xì)胞通透8min。加5μl TdT+45μl熒光素標(biāo)記的dUTP（TUNEL反應(yīng)液），暗盒內(nèi)37℃×1.5h。PBS洗滌5min×3次，玻片干后加50μlconverter-POD于標(biāo)本上37℃×30min，PBS洗滌5min×3次，DAB顯色,蘇木素復(fù)染樹膠封片。陽(yáng)性染色細(xì)胞呈現(xiàn)核質(zhì)固縮、邊緣化，核膜裂解。采用IPP軟件分析：每個(gè)標(biāo)本取3張切片，每張切片取5個(gè)視野,選擇測(cè)定區(qū)域計(jì)數(shù)每視野中血管壁凋亡細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算血管壁單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞比率，取平均值，并以此計(jì)算各組血管壁凋亡細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腹主動(dòng)脈瘤模型建立 腹主動(dòng)脈大體標(biāo)本顯示AngⅡ組、AngⅡ/BaP復(fù)合物組均有腹主動(dòng)脈瘤形成，其中對(duì)照組腹主動(dòng)脈平均周長(zhǎng)（938±108）μm；AngⅡ組腹主動(dòng)脈平均血管周長(zhǎng)（1 204±230）μm，組內(nèi)有3只小鼠靶血管周長(zhǎng)＞1 407μm，AAA形成率為25.00%；BaP組腹主動(dòng)脈平均血管周長(zhǎng)（1053±103）μm，組內(nèi)無(wú)小鼠靶血管周長(zhǎng)＞1 407μm；AngⅡ/BaP復(fù)合物組腹主動(dòng)脈平均血管周長(zhǎng)（1 399±245）μm，有5只小鼠靶血管周長(zhǎng)＞1 407μm，AAA形成率為41.67%。AngⅡ組腹主動(dòng)脈周長(zhǎng)大于對(duì)照組（t=3.26，P＜0.01），而AngⅡ/BaP復(fù)合物組腹主動(dòng)脈周長(zhǎng)顯著大于對(duì)照組、AngⅡ組及BaP組（t= 6.23、2.57、4.73，均P＜0.01）。

2.2 BaP促進(jìn)血管壁彈性纖維紊亂 處理5周后取小鼠腹主動(dòng)脈1cm，石蠟包埋、切片后行HE染色，與對(duì)照組相比，AngⅡ組、BaP組、AngⅡ/BaP組血管中層均有不同程度破壞，管壁變薄；AngⅡ/BaP復(fù)合物組由于中層破壞、膠原纖維退變、彈力纖維紊亂不能耐受主動(dòng)脈內(nèi)血流壓力而發(fā)生動(dòng)脈瘤破裂，局部膨大形成血腫。AngⅡ組血管壁變薄，較BaP組明顯，見插頁(yè)圖1。

2.3 各組小鼠靶血管MMP-3、NF-κB的表達(dá) 見表1。

表1 各組小鼠靶血管MMP-3、NF-κB的表達(dá)（%）

由表1可見，AngⅡ組、BaP組及AngⅡ/BaP復(fù)合物組 MMP-3、NF-κB表達(dá)均較對(duì)照組增加，BaP組MMP-3、NF-κB表達(dá)較AngⅡ組增加（均P＜0.01）；AngⅡ/BaP復(fù)合物組MMP-3、NF-κB表達(dá)增加最明顯，大于AngⅡ組（均P＜0.01）。

2.4 各組小鼠腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡 平滑肌細(xì)胞凋亡率對(duì)照組為（4±2）%，AngⅡ組、BaP組及AngⅡ/BaP復(fù)合物組分別為（19±5）%、（23±4）%、（30±12）%，均高于對(duì)照組（均P＜0.01），而AngⅡ/BaP復(fù)合物組平滑肌細(xì)胞凋亡率高于AngⅡ組及BaP組（t=3.67、2.27，均P＜0.05），見插頁(yè)圖2。

3 討論

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年有數(shù)百萬(wàn)人因吸煙而失去生命[6]，這引起了人們對(duì)香煙煙霧的重視及研究。已有研究證實(shí)吸煙可提高腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率。可見香煙煙霧的成分促進(jìn)了腹主動(dòng)脈瘤的形成，但具體是哪種成份尚未證實(shí)。AAA的主要病理特征是炎癥、彈性纖維退變、血管平滑肌細(xì)胞減少[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BaP可引起C57BL/6N小鼠腹主動(dòng)脈血管壁彈性纖維紊亂，平滑肌細(xì)胞凋亡；而同時(shí)用BaP和血管緊張素處理的小鼠腹主動(dòng)脈血管壁彈性纖維紊亂及血管平滑肌細(xì)胞丟失更加顯著，且AAA的發(fā)生率（42%）要明顯高于僅用AngⅡ（25%）處理的小鼠。這一結(jié)果提示在小鼠腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展中BaP及AngⅡ起著協(xié)同作用。

AAA的病理過程中最顯著的變化是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分彈性纖維網(wǎng)絡(luò)的瓦解和退變[8]。MMP-3又稱間質(zhì)溶解素1，病理狀態(tài)下參與腹主動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生與發(fā)展，其活性增加可促進(jìn)動(dòng)脈壁上彈性纖維退變。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，MMP-3在AAA中的活性較正常動(dòng)脈增高。此外動(dòng)脈壁中膜的主要細(xì)胞成分平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)需依賴細(xì)胞外基質(zhì)的維持，在AAA病程中因MMP-3表達(dá)增加，細(xì)胞外基質(zhì)大量降解不足以支持平滑肌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)而導(dǎo)致大量平滑肌細(xì)胞的凋亡。我們的數(shù)據(jù)顯示：BaP可促進(jìn)C57BL/6N小鼠腹主動(dòng)脈血管壁MMP-3的表達(dá)，BaP聯(lián)合AngⅡ使用后小鼠腹主動(dòng)脈血管壁MMP-3顯著增加，且平滑肌細(xì)胞凋亡明顯，綜上提示BaP對(duì)小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成與MMP-3有關(guān)。

NF-κB是一個(gè)多效而保守的轉(zhuǎn)錄因子，它是促進(jìn)炎癥基因表達(dá)的樞紐，可調(diào)控炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞表面受體、黏附因子等的表達(dá)，控制著機(jī)體防御、組織應(yīng)激、細(xì)胞調(diào)亡等許多重要的生理及病理反應(yīng)過程。在AAA的病理改變中，NF-κB對(duì)MMPs表達(dá)起著調(diào)控作用。抑制NF-κB的活性可顯著降低動(dòng)脈瘤形成概率，并且伴隨著MMPs表達(dá)的下降。結(jié)果提示，香煙煙霧成分BaP可在AngⅡ協(xié)同作用下激活NF-κB通路，使MMP-3表達(dá)增加，進(jìn)而促使彈性纖維紊亂及平滑肌細(xì)胞凋亡，最終形成AAA。

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Benzo［a］pyrene(BaP)promotes abdominal aortic aneurysm formation in mice and its mechanism

Objective To investigate the effect of benzo［a］pyrene(BaP)on the formation of abdominal aortic aneurysm (AAA)in mice and its mechanism．Methods C57BL/6N mice aged 7～9 months were divided into four groups,control group, angiotensinⅡ(AngⅡ)group,BaP group and AngⅡ/BaP group．After 5 weeks of treatment of various agents the abdominal aortas of mice were taken．Aortic tissues were subject to HE,immunochemistry staining for evaluation of vascular wall structure,the expression of matrix metalloproteinase-3,nuclear factor-κB and the apoptosis of vascular smooth muscle cells．Results AngⅡinfusion with BaP injection induced AAA in 41．67%of mice (versus 25%in AngⅡgroup,P＜0．05)．Histological analysis of the aortic wall showed severe damage to the medial layer and breakage of elastic lamella．Immunohistochemistry staining showed that the expression of MMP-3 and NF-κB were increased in AngⅡ/BaP group compared with AngⅡand BaP group(0．48± 0．13%vs 0．24±0．16%and 0．34±0．10%,P＜0．05;0．42±0．12%vs 0．23±0．06%and 0．32±0．09%,P＜0．05)．The apoptosis of aortic vascular smooth muscle cells was highest in AngⅡ/BaP group compared with AngⅡand BaP group(30±12%vs 19±5% and 23±4%,P＜0．05)．Conclusion BaP promotes AngⅡ-induced AAA formation in aging C57BL/6N mice,which may be associated with activating NF-κB,up-regulation of MMP-3 expression,resulting in disarray of elastic lamella,apoptosis of vascular smooth muscle cells,vascular structural destroy and ultimately aneurysm formation．

Benzo(a)pyrene Abdominal aortic aneurysm Matrix metalloproteinase-3 Nuclearfactor-κappa B Smooth muscle cells

2014-03-24）（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學(xué)基金（Y2110550）

310003 杭州市紅會(huì)醫(yī)院心內(nèi)科（蔣鳳春、隋向前）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科（季亢挺、唐疾飛）