趙圣剛 張冉 陳善漿 江力勤

1型糖尿病對(duì)血脂代謝及腎和心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

趙圣剛 張冉 陳善漿 江力勤

目的 探討1型糖尿病對(duì)血脂代謝及腎和心臟組織結(jié)構(gòu)的影響。方法 隨機(jī)選取新西蘭大白兔36只，分為糖尿病組（DM，20只）和對(duì)照組（NC，16只），兩次四氧嘧啶（ALX，80mg/kg）耳緣靜脈注射復(fù)制1型糖尿病模型，期間進(jìn)行血糖控制。飼養(yǎng)4周，觀察兔一般情況，4周末采血檢測(cè)血脂變化，包括TG、TC、LDL-C、HDL-C水平、載脂蛋白（Apo）A1、ApoB100、ApoE，處死兔后膀胱穿刺抽取尿液檢測(cè)尿常規(guī)和尿蛋白定量，分離心臟和腎臟進(jìn)行病理組織檢查。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)造模成功率為55%，死亡率為40%。DM組TC、HDL-C、LDL-C水平顯著高于NC組（P＜0．01），其中TC、TG、LDL-C水平較NC組分別升高97%,48%,130%。DM組TC/HDL-C,LDL-C/HDL-C水平高于NC組（P＜0．01），但TG/HDL-C水平低于NC組；兩組ApoB100、ApoA1/ApoB100、ApoE差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。DM組尿蛋白定量較NC組升高。DM組心肌病理檢查出現(xiàn)輕度-中-重度不同程度的心內(nèi)膜下脂肪變性和沉積，腎臟病理檢查提示腎小球血管袢分葉數(shù)量增加，基底膜及系膜基質(zhì)增生，腎小球體積縮小，部分出現(xiàn)脂肪變替代，腎小管出現(xiàn)不同程度范圍變性甚至壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)鈣鹽沉積。結(jié)論 1型糖尿病可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，引起心臟和腎臟病變，需行積極降脂治療。

糖尿病 高脂血癥 糖尿病腎病 糖尿病心肌病

糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群，可同時(shí)引起血脂代謝異常[1-4]。強(qiáng)化降糖可通過(guò)降低TG、TC、LDL-C水平來(lái)減少心血管病患病風(fēng)險(xiǎn)[5-9]。DCCT研究提示糖化血紅蛋白A1（HbA1c）與TG、TC、LDL-C水平呈強(qiáng)相關(guān)性，但與HDL-C無(wú)相關(guān)性，CACTI研究支持相同結(jié)論[1，10]。糖尿病引起持續(xù)性高血脂促進(jìn)脂肪酸合成和TG蓄積，造成非脂肪組織（肝臟、腎臟、心臟等）脂肪蓄積，導(dǎo)致腎小球和小管損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建糖尿病模型，觀察血脂變化和非脂肪組織脂質(zhì)蓄積情況，評(píng)價(jià)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，為糖尿病患者血脂控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品、儀器 新西蘭大白兔36只，雌雄各18只，體重2～2.5kg，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2009-0039。四氧密啶（ALX Sigma公司生產(chǎn)），使用前用0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為5%的溶液。TC（浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130402）、TG（德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司生產(chǎn)，批號(hào)66684201）、HDL-C（浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130302），LDL-C（上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20130422），載脂蛋白（Apo）A1、ApoB100（上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2013011Q），ApoE（寧波賽克生物技術(shù)公司生產(chǎn)，批號(hào)20130327），尿蛋白定量試劑（德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司生產(chǎn)，批號(hào)67316901）；血糖儀及試紙（美國(guó)羅氏公司），電子天平（上海梅特勒-托利多，JB/T5374-1991），利多卡因、胰島素（10ml∶40U，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司），Roche/Modular/D/P/E全自動(dòng)生化分析儀，Motic生物顯微圖像采集分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 所有兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隔日監(jiān)測(cè)1次空腹血糖，求均值作為動(dòng)物的基礎(chǔ)血糖值。禁食24h后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組（DM組20只），對(duì)照組（NC組16只）。

1.2.2 1型糖尿病模型建立 參照課題組前期制作模型方法[12]，給藥前均禁食12h，利多卡因0.1ml/kg局部麻醉，耳緣靜脈注射四氧嘧啶（ALX），兩次劑量均為80mg/ kg，24h后再次給藥，給藥4h后皮下注射50%葡萄糖8ml，24h后監(jiān)測(cè)血糖，72h后開(kāi)始進(jìn)行血糖管理，皮下注射胰島素控制血糖在16～22mmol/L，若血糖高于3倍的基礎(chǔ)血糖，并持續(xù)2周，則視為建模成功，造模不成功者剔除實(shí)驗(yàn)，NC組注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)飼養(yǎng)4周。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2.3 標(biāo)本收集和檢測(cè) 分別于在用藥72h、1周、2周、4周末耳緣靜脈采血檢測(cè)血糖，測(cè)量3次取平均值，于第4周末耳中央動(dòng)脈采血5ml做血脂相關(guān)檢查。耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）后開(kāi)腹，無(wú)菌注射器抽取膀胱殘余尿液，＞3ml視為合格標(biāo)本，4℃保存后即刻檢驗(yàn)，分離心臟和腎臟。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查 上述臟器用4%甲醛固定,石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色后鏡檢，典型病變采用Motic生物顯微圖像采集分析系統(tǒng)攝影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，尿蛋白與血脂水平的關(guān)系采用Bivarate correlation相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 注射ALX后兔一般狀況 兔出現(xiàn)食欲下降，精神萎靡，少動(dòng)，1周后恢復(fù)，出現(xiàn)多尿、多飲、多食現(xiàn)象，體重減輕，毛色發(fā)黃，容易脫落，血糖濃度升高。實(shí)驗(yàn)造模成功率為55%，死亡率為40%，其中給藥后6d內(nèi)死亡6只，給藥2周后，血糖恢復(fù)正常1只。兩組空腹血糖動(dòng)態(tài)比較見(jiàn)表1。

表1 兩組空腹血糖動(dòng)態(tài)比較（mmol/L）

由表1可見(jiàn)，DM組給藥72h及以后空腹血糖維持在22mmol/L以上，與NC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 兩組血脂及尿蛋白水平比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組血脂及尿蛋白水平比較

由表2可見(jiàn)，DM組TC、HDL-C、LDL-C水平及TC/ HDL-C、LDL-C/HDL-C均高于NC組（均P＜0.01），TG水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組ApoA1、ApoB100、ApoA1/ApoB100、ApoE水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。DM組尿蛋白含量略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相關(guān)性分析顯示尿蛋白水平與TC、TG、HDL-CLDL-C水平無(wú)相關(guān)性（r=0.201、-0.529、0.538、0.128，均P＞0.05）。

2.3 心臟病理檢查結(jié)果 NC組心肌細(xì)胞排列整齊，呈粉紅色，胞質(zhì)、胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌縱切面肌纖維細(xì)長(zhǎng)呈圓柱形，分支并互相連成網(wǎng)，心肌纖維間有少量結(jié)締組織，未見(jiàn)異常；DM組可出現(xiàn)細(xì)胞水腫，排列紊亂，間質(zhì)增生，出現(xiàn)輕度-中-重度不同程度的心內(nèi)膜下脂肪變性和沉積，見(jiàn)插頁(yè)圖1。

2.4 腎臟病理檢查結(jié)果 NC組兔腎臟腎小球結(jié)構(gòu)清晰，球囊壁光滑，腎小管未見(jiàn)異常；DM組可見(jiàn)腎小球血管袢分頁(yè)數(shù)量增加，基底膜及系膜基質(zhì)增生，腎小球體積縮小，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少，部分出現(xiàn)脂肪變替代,腎小管出現(xiàn)不同程度范圍變性甚至壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)鈣鹽沉積，見(jiàn)插頁(yè)圖2。

3 討論

糖尿病屬代謝障礙性疾病，常伴有脂質(zhì)代謝障礙，糖代謝異常與脂代謝異?；橐蚬鸞1-4，13]，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病、冠心病、腦血管病的主要危險(xiǎn)因素[7]。DCCT/EDIC研究提示糖尿病通過(guò)誘發(fā)高血脂和脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致心血管疾病[6，10-11]，血糖水平與血脂水平呈強(qiáng)相關(guān)，HbA1c變化與TC、LDL-C、non-HDL-C水平呈正相關(guān)，與HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)[1]，強(qiáng)化胰島素治療可顯著降低TC、LDL-C、TG水平[5-9]，最新2013ACC/AHA指南主張對(duì)糖尿病患者進(jìn)行積極地降脂治療[14]。胰島素可抑制脂肪細(xì)胞激素敏感性激酶釋放，激活脂蛋白脂酶，同時(shí)促進(jìn)肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)化為T(mén)G，進(jìn)而以VLDL-C形式分泌。胰島素抵抗或缺乏可顯著影響血脂水平，血脂譜以及脂肪酸構(gòu)成比例，脂質(zhì)攝取和代謝之間平衡被打破[15-16]，糖尿病并發(fā)的脂質(zhì)代謝障礙可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，胰島素分泌障礙，進(jìn)入惡性循環(huán)狀態(tài)[17]。糖尿病通過(guò)高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂引起腎功能減退[14-17]，腎臟脂肪酸β氧化通路活性降低，脂蛋白脂酶表達(dá)降低，LDLC受體和氧化LDL-C受體表達(dá)增加，同時(shí)脂質(zhì)外流機(jī)制（ABCA1，ABGC1，ApoE）降低，導(dǎo)致腎臟脂質(zhì)蓄積。脂毒性和脂質(zhì)蓄積造成足突細(xì)胞凋亡，腎小球和腎間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞可攝取大量氧化LDL-C，形成泡沫細(xì)胞，釋放趨化因子和炎癥介質(zhì)，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，增加氧自由基，引起腎小球的基質(zhì)沉積，導(dǎo)致腎小球肥大，繼而硬化造成腎功能減退[15]。1型糖尿病腎病的嚴(yán)重程度與LDL-C、HDL-C、VLDL-C水平密切相關(guān)，非諾貝特和他汀強(qiáng)化降脂可顯著延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[16]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟病理檢查提示腎小球血管袢分葉數(shù)量增加，基底膜及系膜基質(zhì)增生，呈團(tuán)塊狀，腎小球體積縮小，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少，部分出現(xiàn)脂肪變，腎小管出現(xiàn)不同程度范圍變性甚至壞死，腔內(nèi)可見(jiàn)鈣鹽沉積，雖然未見(jiàn)典型K-W結(jié)節(jié)及纖維蛋白帽提示糖尿病腎病造模成功。心臟病理檢查提示心內(nèi)膜下心肌脂質(zhì)蓄積，考慮由于過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α活化，導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶激酶-4表達(dá)增加，減少糖氧化，同時(shí)通過(guò)CD36和脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)的增加，促進(jìn)線粒體脂肪酸攝入，影響心肌能量代謝，引起糖尿病心肌病[18]。血脂檢查提示TG、TC、LDL-C水平升高，但本實(shí)驗(yàn)得出HDL-C水平較NC組升高，考慮為不同物種或者樣本數(shù)量偏少有關(guān)，TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C水平升高提示存在心血管病風(fēng)險(xiǎn)，但與HDL-C相關(guān)ApoA1和與LDL-C相關(guān)的ApoB100水平未見(jiàn)異常，轉(zhuǎn)運(yùn)血脂ApoE可見(jiàn)DM組下降，可見(jiàn)糖尿病可引起顯著血脂代謝障礙，參與到糖尿病腎病形成，尿蛋白水平DM組高于NC組，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能由于本實(shí)驗(yàn)小樣本或者實(shí)驗(yàn)周期尚不足引起顯著尿蛋白。

本實(shí)驗(yàn)得出糖尿病導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，增加心血管及其他大血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，可引起心臟和腎臟結(jié)構(gòu)改變，需行積極降脂治療。

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Lipid abnormalities,renal and cardiac histology changes in rabbits with type 1 diabetes

Objective To investigate the changes of lipid metabolism,renal and cardiac histology in type 1 diabetes．Methods Thirty six New Zealand rabbits were randomly divided into diabetes mellitus group(DM,n=20)and normal control group(NC,n=16)．Type 1 diabetes was induced by injection of Alloxan(80mg/kg)twice via ear marginal venous,the same volume of normal saline was injected in NC group．The general conditions,body weight,food and water intake were observed for 4 weeks after injection;blood total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),apolipoprotein A(apoA),apolipoprotein B(apoB)and apolipoprotein E(apoE)levels were determined,and routine urine test,urine protein were measured by the end of the experiment;and histopathological examination of heart and renal were performed．Results The TC,HDL-C,LDL-C levels and TC/HDL-C,LDL-C/HDL-C in DM group were significantly higher than those in NC group (P＜0．01),but there was no significant difference in ApoB100 levels and ApoA1/ApoB100 between two groups．Compared to NC group the levels of TC,TG,LDL-C in DM group were elevated by 97%, 48%and 130%,respectively;there were no statistical differences in the ratio of TG/HDL-C and ApoE level between two groups．The urine protein level in DM group was higher than that in NC group．Histopathological examination showed that there were cell edema,disordered arrangement of myocardial fibers,interstitial enlargement,mild-moderate-severe lipid accumulation and fatty degeneration under the epicardium in the heart of DM group．Basement membrane and mesangial matrix proliferation, glomerular volume shrinking and glomerular fatty degeneration,mild-moderate-severe tubular degeneration and necrosis,calcium salt deposits were observed in the cavity of distal convoluted tubule in diabetic kidney．Conclusion Type 1 diabetes may result in dyslipidemia and heart and kidney dysfunction,which are associated with pathogenesis of diabetic nephropathy and cardiomyopathy．

Diabetes mellitus Lipid abnormality Diabetic nephropathy Diabetic cardiomyopathy

2014-06-23）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110934）

314000 嘉興市第二醫(yī)院心內(nèi)科（趙圣剛、張冉、江力勤）；溫州市中心醫(yī)院心內(nèi)科（陳善漿）通信作者：江力勤，E-mail：jiangliqin@medmail.com.cn