高瞻 施翔翔 黃曉燕 楊德業(yè)

●論 著

Pax-8基因敲除小鼠心肌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因的研究

高瞻 施翔翔 黃曉燕 楊德業(yè)

目的 研究Pax-8基因敲除小鼠心肌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。方法 利用基因芯片技術(shù)初篩在Pax-8基因敲除純合子小鼠（Pax-8-/-）和雜合子小鼠（Pax-8+/-）心肌組織中差異表達(dá)的基因，運(yùn)用半定量RT-PCR檢驗(yàn)初篩結(jié)果，并運(yùn)用熒光實(shí)時定量PCR確定初篩所得的差異表達(dá)的基因在Pax-8基因敲除純合子、雜合子以及野生型小鼠（Pax-8+/+）心肌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 基因Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7在Pax-8-/-中的表達(dá)分別是其在Pax-8+/-中表達(dá)的2．07±0．08、1．13±0．01、1．30± 0．01、1．53±0．08及0．75±0．03倍（均P＜0．01）。是在Pax-8+/+中表達(dá)的2．23±0．16、1．67±0．05、1．77±0．21、4．8±0．35及0．9± 0．04倍（P＜0．01或0．05）。結(jié)論 Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7上述5個基因在Pax-8基因敲除的心肌細(xì)胞中差異表達(dá)，參與Pax-8基因敲除小鼠的一系列心臟病理生理變化。

Pax-8 基因 小鼠 心肌細(xì)胞

室間隔缺損（VSD）作為常見的先天性心臟病，至今病因及發(fā)病機(jī)制仍未明確，但通常認(rèn)為與胚胎時期原始心管發(fā)育異常有關(guān)。Pax-8基因特異性的表達(dá)于小鼠胚胎心臟與甲狀腺之中，參與了心臟的正常發(fā)育[1-2]，并與胚胎心肌細(xì)胞的生長和凋亡有關(guān)[3]，Pax-8-/-小鼠心臟解剖可見心臟呈球形，左心室壁肥厚，室間隔增厚，左心室乳頭肌肥大。免疫組化證實(shí)Pax-8-/-小鼠心臟左心室壁和室間隔心肌組織細(xì)胞凋亡增高，線粒體體積縮小、數(shù)量增多。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)抑制Pax-8基因表達(dá)后顯著增加細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞增值活性[4]。本文旨在探討Pax-8基因下調(diào)后引起心肌細(xì)胞凋亡增加的機(jī)制，并運(yùn)用基因芯片和PCR技術(shù)尋找Pax-8基因敲除后心肌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Pax-8基因敲除小鼠由德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所惠贈。實(shí)驗(yàn)組為Pax-8基因敲除小鼠純合子（Pax-8-/-），對照組為Pax-8基因敲除小鼠雜合子（Pax-8+/-）和野生型（Pax-8+/+）。2只Pax-8+/-小鼠交配可獲得Pax-8-/-和Pax-8+/-以及Pax-8+/+小鼠。

1.2 方法

1.2.1 Pax-8-/-小鼠的基因型鑒定 新生小鼠剪取尾巴末端提取DNA經(jīng)PCR法鑒定基因型。引物為5＇-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3＇，5＇-GCTAAGA-GAAGGTGGATGAGAG-3＇，和5＇-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3＇。PCR條件：94℃、5min，94℃、15s,60℃、15s,72℃、30s,94℃、15s,57℃、15s,72℃、30s,25個循環(huán),72℃、5min。

1.2.2 芯片雜交 取Pax-8-/-組與Pax-8+/-組出生第1天（P0）小鼠各3只，TRIzol法常規(guī)提取心臟組織的總RNA，經(jīng)紫外吸收測定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，參照上海生物芯片有限公司試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化。Cy3-dUTP標(biāo)記Pax-8-/-cDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記Pax-8+/-cDNA，將含31 802個小鼠基因的表達(dá)譜芯片（Mouse OneArrayTM，購自臺灣華聯(lián)生物科技）和探針雜交。結(jié)果采用Axon公司的Gene Pix4100掃描，Gene PixPro4.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強(qiáng)度和比值。用看家基因進(jìn)行Cy3和Cy5均衡。Cy3和Cy5信號比值＞2.0為表達(dá)上調(diào)，＜0.5為表達(dá)下調(diào)，0.5～2.0為不存在顯著表達(dá)差異。

1.2.3 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法驗(yàn)證基因芯片篩查結(jié)果 取Pax-8-/-組與Pax-8+/-組P0小鼠各3只，TRIzol法常規(guī)提取心臟組織總RNA做逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)基因篩選結(jié)果，用RT-PCR引物進(jìn)行半定量PCR檢測。采用GAPDH基因作為內(nèi)部參照。基因、引物、反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物每組取6μl用含Gold View的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

表1 半定量RT-PCR引物和反應(yīng)條件

1.2.4 熒光實(shí)時定量RT-PCR 取Pax-8-/-組、Pax-8+/-組和Pax-8+/+組P0小鼠各3只，TRIzol法常規(guī)提取心臟組織總RNA做逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)基因芯片篩選和半定量RTPCR所得的上調(diào)和下調(diào)的候選基因設(shè)計引物，通過實(shí)時定量RT-PCR進(jìn)行熒光定量PCR檢測。采用Beta-actin作為內(nèi)部參照。基因、引物、反應(yīng)條件見表2。用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次。通過比較ΔCt的方法進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析，Ct為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt為目的基因值與內(nèi)參Beta-actin Ct值之差。目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔCt表示。ΔΔCt為兩目的基因ΔCt值之差。兩目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

表2 定量RT-PCR引物和反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5.0統(tǒng)計軟件，經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Pax-8基因敲除小鼠模型PCR鑒定結(jié)果 Pax-8-/-表現(xiàn)為約370bp的單一條帶，Pax-8+/+表現(xiàn)為約390bp的單一條帶，Pax-8+/-表現(xiàn)為390bp和370bp雙條帶（圖1）。

圖1 PCR鑒定Pax-8基因敲除小鼠的基因型

2.2 Pax-8基因敲除小鼠中差異表達(dá)的基因 見表3。

由表3可見，通過基因芯片對31 802個已知基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與Pax-8+/-組相比，在Pax-8-/-組中25個基因表達(dá)下調(diào)，另外17個基因表達(dá)上調(diào)，其中涉及細(xì)胞周期，直接參與代謝的酶，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及核轉(zhuǎn)錄因子等基因。

2.3 半定量RT-PCR法驗(yàn)證基因芯片篩查結(jié)果 經(jīng)過對上述42個基因逐個進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證，相當(dāng)部分基因RT-PCR結(jié)果未顯示差異性，最終初步篩選出5個差異表達(dá)的基因，見表4。

由表4可見，差異表達(dá)的5個基因，Pax-8-/-總RNA在進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時，F(xiàn)gf-6、NR4A1以及Lck的擴(kuò)增產(chǎn)物較Pax-8+/-提前4個循環(huán)被發(fā)現(xiàn)，Tcf7的擴(kuò)增產(chǎn)物落后4個循環(huán)出現(xiàn)，而BCL2l14基因只能在Pax-8-/-總RNA中獲得擴(kuò)增。

2.4 熒光定量RT-PCR結(jié)果 見表5。

由表5可見，Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7在Pax-8-/-中的表達(dá)分別是其在Pax-8+/-中表達(dá)的2.07± 0.08、1.13±0.01、1.30±0.01、1.53±0.08及0.75±0.03倍（均P＜0.01）。是在Pax-8+/+中表達(dá)的2.23±0.16、1.67±0.05、1.77±0.21、4.8±0.35及0.9±0.04倍（P＜0.01或0.05）。

3 討論

即使在胚胎心臟發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡也在不停的發(fā)生，胚胎心臟各部位，如房室心內(nèi)膜墊、間隔、肌小梁和乳頭肌等，均具有立體的復(fù)雜的三維解剖結(jié)構(gòu)。他們的形成需要細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡平衡進(jìn)行[5]。室間隔的形成同樣如此[6]，若細(xì)胞凋亡與增殖失去平衡，凋亡增加而增殖減少，就可能導(dǎo)致VSD形成。

通過以上研究我們可以發(fā)現(xiàn)，Pax-8基因敲除后，可以導(dǎo)致Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7等5個基因表達(dá)量發(fā)生改變，它們均是細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)的基因并且相互之間存在復(fù)雜的關(guān)系：Bcl2l14是Bcl-2基因家族成員，Bcl-2家族含有4個同源結(jié)構(gòu)域，而Bcl2l14編碼的蛋白含有其中的BH3及BH2 2個同源結(jié)構(gòu)域，當(dāng)Bcl2l14被激活，脫落BH2結(jié)構(gòu)域而只剩下BH3時，可以顯著增加細(xì)胞的凋亡。Lck在Th2細(xì)胞分化中有重要作用，參與CD8+細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)并且可以調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酸化過程。Bcl-2受NR4A1調(diào)節(jié)，NR4A1在磷酸化后可與Bcl-2蛋白結(jié)合使其中的BH3暴露，從而激活Bcl-2蛋白。Fgf-6有高度的組織特異性，絕大部分表達(dá)肌源性細(xì)胞。他能夠誘導(dǎo)靜息的肌肉干細(xì)胞——肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖、遷移，促進(jìn)肌母細(xì)胞增殖[7]。Fgf-6的受體Fgfr4本身也是同為Pax家族的Pax-3的下游基因，同時Pax-3還是MyoD的上游基因，而MyoD的表達(dá)是靜息的衛(wèi)星細(xì)胞活化的標(biāo)志。Pax-7因與Pax-3有相似的DNA結(jié)合特性與活性，也發(fā)揮了同樣的作用，顯示了Pax家族與Fgf家族之間的復(fù)雜關(guān)系。

表3 Pax-8+/-與Pax-8-/-心肌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因

表4 P0 Pax-8-/-和Pax-8+/-小鼠心臟中5個差異表達(dá)的基因不同PCR擴(kuò)增周期的產(chǎn)量比較

表5 5個差異表達(dá)的基因的定量RT-PCR結(jié)果

我們可以大膽假設(shè)：在Pax-8基因敲除小鼠心臟中，可能存在由Lck磷酸化NR4A1起始的，由NR4A1激活Bcl2l14使得細(xì)胞凋亡增加，乃至導(dǎo)致VSD形成。而Fgf-6的表達(dá)上調(diào)，可能是機(jī)體對過度凋亡的心肌細(xì)胞的一種代償機(jī)制，也可能是Fgf-6本身即作為Pax-8基因的下游基因受其調(diào)控。但是基因及其表達(dá)的蛋白相互之間復(fù)雜的相互的直接或間接的影響，這種假設(shè)還缺乏直接依據(jù)，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1]楊德業(yè),張懷勤,黃嘵燕,等．室間隔缺損相關(guān)基因-BMPR下游基因的探討[J]．溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,33(2):76-78．

[2]楊德業(yè),宋后燕,張懷勤,等．心肌組織Pax8基因的研究[J]．中華兒科雜志,2003,41(10):770-772

[3] 章佳穎,來丹丹,褚茂平,等．Pax-8基因在胚胎心臟發(fā)育中的作用[J]．中國病理生理雜志,2009,25(7):1292-1297．

[4] 高瞻,來丹丹,張敏,等．Pax-8基因在大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用[J]．解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(9):1082-1084．

[5]Watanabe M,Choudhry A,Berlan M,et al．Developmental remodeling and shortening of the cardiac outflow tract involves myocyte programmed cell death[J]．Development,1998,125(19): 3809-3820．

[6]Abdelwahid E,Pelliniemi L J,Niinikoski H,et al．Apoptosis in the pattern formation of the ventricular wall during mouse heart organogenesis[J]．TheAnatomicalRecord,1999,256(2):208-217．

[7]黃曉燕,高瞻,來丹丹,等．Pax-8基因敲除小鼠心臟中Fgf-6基因表達(dá)的上調(diào)及其意義[J]．浙江醫(yī)學(xué),2010,31(11):1591-1593．

（致謝：此課題的完成得到德國Peter Gruss及Ahmed Mansouri教授的支持和幫助，尤其是惠贈實(shí)驗(yàn)動物，特此表示感謝?。?/p>

Differentially expressed genes in myocardium of Pax-8 gene knockout mice

Objective To investigate differentially expressed genes in myocardium of Pax-8 gene knockout mice．Methods Candidate Pax-8 downstream genes were screening by mouse genome DNA microarray with Pax-8-/-and Pax-8+/-cDNA,then tested by semi-quantitative RT PCR．Real time RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed downstream genes．Results The expression of genes Bcl2l14,Fgf-6,Lck,Nr4a1 and Tcf7 in Pax-8-/-mice was 2．07±0．08,1．13± 0．01,1．3±0．01,1．53±0．08,0．75±0．03 times as expressed in Pax-8+/-mice(P＜0．01),and 2．23±0．16,1．67±0．05,1．77±0．21, 4．8±0．35(P＜0．01),0．9±0．04(P＜0．05)times as expressed in Pax-8+/+mice,respectively．Conclusion Genes Bcl2l14,Fgf-6, Lck,Nr4a1 and Tcf7 were differentially expressed in myocardium of Pax-8 gene knockout mice,which might be involved in a series of pathophysiologic changes in the gene knockout myocardium．

Pax-8 Gene Mouse Myocardium

2014-01-06）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學(xué)基金資助項目（30571050）；溫州市科技發(fā)展計劃資助項目（Y2006A017）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科（高瞻、施翔翔、黃曉燕）；杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科（楊德業(yè)）

楊德業(yè)，E-mail：deyeyang@126.com