陳慧君 王瑞麗 戴元榮

羅紅霉素經(jīng)caveolin-1-p-ERK 1/2對(duì)離體哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞cyclinD1表達(dá)的影響

陳慧君 王瑞麗 戴元榮

目的 探討羅紅霉素（RXM）經(jīng)caveolin-1-p-ERK1/2對(duì)離體哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）cyclinD1表達(dá)的影響。方法將30只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和哮喘組，以卵白蛋白致敏和激發(fā)復(fù)制哮喘氣道重塑模型；采用Image-Pro Plus Version 6．0圖像分析軟件測(cè)定支氣管壁和支氣管平滑肌層厚度；透射電鏡觀察兩組大鼠ASMCs微囊表達(dá)情況；CCK-8檢測(cè)不同濃度RXM[A組（只含0．1%DMSO）、R10組（含RXM10μg/ml+0．1%DMSO）、R25組（含RXM 25μg/ml+0．1%DMSO）、R50組（含RXM50μg/ml+0．1%DMSO）、R100組（含RXM 100μg/ml+0．1%DMSO）]干預(yù)哮喘ASMCs后細(xì)胞的增殖情況，Western blot測(cè)定caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表達(dá)。結(jié)果哮喘組支氣管壁和支氣管平滑肌層明顯增厚，而微囊表達(dá)匱乏。哮喘組大鼠支氣管壁與平滑肌層厚度均高于對(duì)照組（均P＜0．01）。各RXM干預(yù)組ASMCs A值均低于A組，其中R100組明顯低于A組（P＜0．05）。R100組caveolin-1表達(dá)明顯高于A組及R10組，cyclinD1表達(dá)明顯低于A組及R10組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）；R25、R50、R100組P-ERK表達(dá)均明顯低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）。哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0．05），與p-ERK及cyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．05或0．01）；caveolin-1與p-ERK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0．01），與cyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．01）；p-ERK與cyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．01）。結(jié)論RXM可能通過(guò)上調(diào)caveolin-1表達(dá)、抑制ERK1/2活化，進(jìn)而影響cyclinD1的表達(dá)，從而抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。

哮喘 氣道平滑肌細(xì)胞 Caveolin-1 p-ERK1/2 cyclinD1 羅紅霉素

氣道重塑是哮喘的重要特征，其結(jié)構(gòu)改變包括氣道上皮損傷、上皮下纖維化、氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖、杯狀細(xì)胞增生肥大以及血管生成[1]，其中ASMCs增殖在氣道重塑中的作用受到廣泛關(guān)注[2]。微囊是存在于細(xì)胞膜上的內(nèi)陷微結(jié)構(gòu)，微囊蛋白（caveolins）為其標(biāo)記蛋白。研究表明，caveolins可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖，其表達(dá)缺失與細(xì)胞過(guò)度增殖有關(guān)[3]。而caveolins中的caveolin-1在ASMCs中表達(dá)豐富。ERK1/2信號(hào)通路激活后可作用于核轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，筆者的前期研究證實(shí)哮喘大鼠氣道平滑肌層ERK1/2活化增加[4]。細(xì)胞增殖最終需通過(guò)細(xì)胞周期完成有絲分裂過(guò)程，在整個(gè)細(xì)胞周期中，G1/S期是真核細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的“限制點(diǎn)”，決定細(xì)胞是否進(jìn)入周期進(jìn)行有絲分裂。近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞周期素D1（cyclinD1）與此“限制點(diǎn)”密切相關(guān)。羅紅霉素（roxithromycin，RXM）是一種半合成的十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，可以抑制哮喘大鼠氣道重塑，但其機(jī)制并未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠慢性哮喘模型，體外培養(yǎng)ASMCs，探討RXM是否可經(jīng)caveolin-1-p-ERK1/ 2對(duì)cyclinD1表達(dá)產(chǎn)生影響，從而抑制離體哮喘ASMCs的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD級(jí)大鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量100～120g。隨機(jī)分為對(duì)照組及哮喘組，每組15只。主要試劑：卵白蛋白（OVA，美國(guó)Sigma公司），兔源性caveolin-1多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），小鼠源性P-ERK1/2單克隆抗體、兔源性總ERK1/ 2單克隆抗體、小鼠源性cyclinD1單克隆抗體（美國(guó)Cell Siganling公司），HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），RXM粉劑（法國(guó)Usiphar公司）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠氣道重塑模型制備 參照Palmans等[5]的方法制備哮喘大鼠氣道重塑模型。致敏階段：第1天和第8天腹腔注射含1mg OVA和100mg氫氧化鋁的混合液1ml；激發(fā)階段：第15天開(kāi)始霧化吸入氯化鈉溶液8ml（0.9%氯化鈉溶液與OVA混合，OVA終濃度為1%）激發(fā)哮喘，30min/次，隔日1次，共8周。對(duì)照組致敏階段腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml，激發(fā)階段以0.9%氯化鈉溶液8ml霧化。

1.2.2 支氣管壁與支氣管平滑肌層厚度測(cè)定 采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件測(cè)量?jī)山M大鼠支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管管壁總面積（Wat）、支氣管平滑肌面積（Wam）。并用Pbm將測(cè)得的Wat、Wam標(biāo)準(zhǔn)化，以Wat/Pbm、Wam/Pbm分別代表支氣管壁和平滑肌層厚度。

1.2.3 ASMCs體外培養(yǎng)及鑒定 按照文獻(xiàn)[6]所報(bào)道的方法培養(yǎng)原代及傳代ASMCs。取第3代ASMCs進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。

1.2.4 ASMCs微囊表達(dá)變化觀察 兩組大鼠均取第3～6代ASMCs制作電鏡標(biāo)本，采用透射電鏡觀察微囊的表達(dá)情況。

1.2.5 RXM對(duì)哮喘大鼠ASMCs增殖的影響 將哮喘大鼠的ASMCs單細(xì)胞懸液按2×105/ml的密度接種于96孔板，100μl/孔，隨機(jī)分為A組（只含0.1%DMSO）、R10組（含RXM10μg/ml+0.1%DMSO）、R25組（含RXM 25μg/ml+0.1%DMSO）、R50組（含RXM50μg/ml+0.1% DMSO）、R100組（含RXM 100μg/ml+0.1%DMSO），并設(shè)立空白組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。首先用不含血清的RPMI 1640饑餓24h，使細(xì)胞同步于G0期，然后用含不同濃度RXM的10%F月S RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μl的CCK-8試劑，混勻后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔吸光度A值。取6個(gè)復(fù)孔的平均值作為該組的代表值，重復(fù)5次。依下列公式計(jì)算各組ASMCs增殖活性：細(xì)胞增殖活性（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As代表實(shí)驗(yàn)孔吸光度值（含培養(yǎng)基、CCK-8、ASMCs、不同濃度RXM）；Ac：代表對(duì)照孔吸光度值（含培養(yǎng)基、CCK-8、ASMCs）；Ab：代表空白孔吸光度值（含培養(yǎng)基、CCK-8）。

1.2.6 caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表達(dá) 采用Western blot測(cè)定。取第6代哮喘大鼠的ASMCs，按“1.2.5 RXM對(duì)哮喘大鼠ASMCs增殖的影響”中的分組方法干預(yù)哮喘ASMCs，提取蛋白，月CA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂牛奶搖床封閉1h，分別加caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶1 000）、p-ERK小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶1 000）、cyclinD1小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜。次日洗膜后加5%脫脂牛奶稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 500）或羊抗小鼠二抗（1∶2 500），室溫下?lián)u床孵育1h，洗膜后滴加ECL發(fā)光液，根據(jù)熒光強(qiáng)弱選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間顯影、定影。Gel pro軟件分析caveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白光密度（OD）值，并與內(nèi)參OD值比較作為各目的蛋白相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以表示。正態(tài)分布資料的多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料的多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)；兩變量的相關(guān)分析用Pearson直線相關(guān)法。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肺組織病理學(xué)改變情況 對(duì)照組大鼠結(jié)構(gòu)完整，支氣管及血管周圍未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管平滑肌層未見(jiàn)明顯增厚（圖1）。哮喘組大鼠支氣管平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄，周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。

圖1 對(duì)照組大鼠肺組織病理改變（HE染色，×200）

圖2 哮喘組大鼠肺組織病理改變（HE染色，×200）

2.2 兩組大鼠支氣管壁和平滑肌厚度比較 對(duì)照組大鼠支氣管壁與平滑肌層厚度分別為（46.83±21.09）、（23.16± 2.79）μm，哮喘組大鼠分別為（105.72±24.31）、（45.93±14.59）μm，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.3 ASMCs體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 體外培養(yǎng)的ASMCs于倒置顯微鏡下觀察呈束狀或螺旋狀，可觀察到典型的“峰-谷”狀（平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要特征，圖3）。平滑肌細(xì)胞內(nèi)特異的α-actin免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞內(nèi)的肌絲結(jié)構(gòu)，沿細(xì)胞的縱軸分布（平滑肌細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，圖4）。

2.4 兩組大鼠ASMCs微囊透射電鏡觀察情況 正常組大鼠ASMCs微囊含量豐富，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)及大小多變（圖5）；哮喘組大鼠ASMCs微囊表達(dá)明顯匱乏，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重（圖6）。

圖3 倒置顯微鏡下體外培養(yǎng)ASMCs（×100）

圖4 激光共聚焦顯微鏡下ASMCs內(nèi)部紅色絲狀物（×400）

圖5 透射電鏡下正常組ASMCs微囊（×6 000）

圖6 透射電鏡下哮喘組ASMCs微囊（×6 000）

2.5 不同濃度RXM對(duì)哮喘大鼠ASMCs增殖的影響 細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深，所測(cè)吸光度A值越大。A組、R10組、R25組、R50組及R100組ASMCs A值分別為 0.64±0.13、0.54±0.13、0.52±0.12、0.45±0.13、0.38± 0.12，增殖活性分別為100%、87.6%、84.2%、73.4%、60.4%，各RXM干預(yù)組ASMCs A值均低于A組，其中R100組明顯低于A組（P＜0.05）。

2.6 各組哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表達(dá) 見(jiàn)表1及圖7-9。

表1 各組哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表達(dá)

由表1可見(jiàn)，R100組caveolin-1表達(dá)明顯高于A組及R10組，cyclinD1表達(dá)明顯低于A組及R10組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；R25、R50、R100組P-ERK表達(dá)均明顯低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.7 相關(guān)關(guān)系 哮喘ASMCs增殖活性與caveolin-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.881，P＜0.05），與p-ERK及cy-clinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.933、0.988，P＜0.05或0.01）；caveolin-1與p-ERK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.811，P＜0.01），與cyclinD1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.696，P＜0.01）；p-ERK與cyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.921，P＜0.01）。

圖7 caveolin-1的表達(dá)

圖8 P-ERK的表達(dá)

圖9 cyclinD1的表達(dá)

3 討論

RXM是一種半合成的十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，不但有抗菌活性，而且還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化活性[7]。戴元榮等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，RXM與吸入性糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用，可提高哮喘的治療療效。吳立琴等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，RXM可通過(guò)PI3K途徑抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。本研究結(jié)果顯示，隨著RXM干預(yù)濃度增高，細(xì)胞增殖活性逐漸下降，表明RXM抑制哮喘ASMCs增殖的作用具有濃度依賴性，當(dāng)RXM濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖所受抑制明顯高于A組。

Caveolae是一種內(nèi)陷微結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞增殖相關(guān)的受體和信號(hào)蛋白在該結(jié)構(gòu)中明顯富集[10]，提示caveolae可能參與細(xì)胞增殖過(guò)程。Caveolin-1是一種分子量為22kDa的跨膜蛋白，其N端含有一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的鉸手架區(qū)域，可以連接并調(diào)控多種受體和信號(hào)蛋白[11]。Gosens等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在絲裂原缺乏的條件下，siRNA敲除caveolin-1仍可導(dǎo)致ASMCs增殖，而且還發(fā)現(xiàn)在處于增殖狀態(tài)的平滑肌細(xì)胞caveolin-1的含量只有靜止?fàn)顟B(tài)下的一半，提示caveolin-1可能負(fù)性調(diào)控ASMCs的增殖。本研究結(jié)果顯示，正常組大鼠ASMCs caveolae表達(dá)豐富，大小及體積多變，而哮喘組大鼠ASMCs caveolae表達(dá)明顯匱乏而平滑肌層明顯增厚，提示哮喘組大鼠caveolae/caveolin-1缺乏與ASMCs過(guò)度增殖有關(guān)；此外還發(fā)現(xiàn)，RXM干預(yù)哮喘組大鼠ASMCs后，caveolin-1表達(dá)增加，且與細(xì)胞增殖活性呈負(fù)性相關(guān)，提示RXM可通過(guò)增加caveolin-1的表達(dá)而發(fā)揮其抑制ASMCs增殖的作用。

ERK1/2可將信號(hào)由細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖和分化緊密相關(guān)。筆者的前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠氣道平滑肌層ERK1/ 2的活化增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，采用β-環(huán)糊精或siRNA敲除caveolin-1可導(dǎo)致ERK1/2活化。本研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1表達(dá)與哮喘ASMCs增殖活性呈負(fù)相關(guān)，ERK1/2的活化與哮喘ASMCs增殖活性呈正相關(guān)，caveolin-1與p-ERK1/2的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，而且RXM干預(yù)哮喘ASMCs后caveolin-1表達(dá)增加、ERK1/2活化減少，提示RXM可通過(guò)上調(diào)caveolin-1表達(dá)、抑制ERK1/2活化而抑制ASMCs的增殖。

G1/S是真核細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的“限制點(diǎn)”。研究表明，cyclinD1與哮喘ASMCs增殖密切相關(guān)[13]。張愛(ài)芝等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)通路可能通過(guò)對(duì)cyclinD1表達(dá)的調(diào)控而影響哮喘ASMCs增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘ASMCs增殖活性及p-ERK蛋白表達(dá)均與cyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)，caveolin-1蛋白表達(dá)與cyclinD1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而且RXM干預(yù)哮喘ASMCs后，隨著caveolin-1上調(diào)、ERK1/2活化被抑制，cyclinD1表達(dá)逐漸下降，提示RXM可能通過(guò)caveolin-1-p-ERK1/2抑制了cyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，從而抑制哮喘ASMCs增殖，但其確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of roxithromycin on cyclin D1 expression in airway smooth muscle cells of asthmatic rats and its mechanism

Objective To investigate the effect of roxithromycin(RXM)on cyclinD1 expression in cultured airway smooth muscle cells（ASMCs）of asthmatic rats and its mechanism．MethodsThirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and asthmatic group．The chronic asthma was induced by the sensitization and provocation of ovalbumin in rats．The total bronchial wall thickness(Wat/Pbm)and the bronchial smooth muscle thickness(Wam/Pbm)were measured with image-pro plus 6．0；the changes of caveolae in AMSCs were observed by transmission electron microscope．The proliferation of cultured ASMCs induced by different concentrations of roxithromycin(group A:0．1%DMSO,group R10:RXM10μg/mL+0．1%DMSO,groupR25:RXM 25μg/ml+0．1%DMSO,group R50:RXM50μg/ml+0．1%DMSO,group R100:RXM 100μg/ml+0．1%DMSO)was tested by CCK-8．The protein expressions of caveolin-1,P-ERK,cyclinD1 of ASMCs were measured by Western blot．ResultsThe Wat/Pbm,Wam/Pbm of asthmatic group were significantly higher than those of control group(P＜0．01)．There were a few of caveolae in ASMCs of asthmatic rats．A value in all intervention groups was lower than that in group A,particularly in group R100 (P＜0．05)．The expression of caveolin-1 in group R100 was significantly higher and the expression of cyclinD1 was significantly lower than those in group A and group R10(P＜0．05 or P＜0．01);the expression of P-ERK in group R25,R50,R100 were significantly lower than those in group A(P＜0．05 or P＜0．01)．There were significantly negative correlation of cell activity rate of asthmatic rats with the expressions of caveolin-1 protein(P＜0．05)and positive correlation with the expressions of P-ERK or cyclinD1 protein(P＜0．05 or P＜0．01)．The expression of caveolin-1 protein was negatively correlated with P-ERK and cyclinD1(P＜0．01), and the expression of P-ERK protein was positively correlated with cyclinD1(P＜0．01)．ConclusionRoxithromycin inhibits cy-clinD1 expression and cell proliferation in ASMCs from asthmatic rats,which is associated with up-regulation of caveolin-1 expressions and down-regulation of p-ERK expressions．

Asthma Airway smooth muscle cells Caveolin-1 p-ERK Roxithromycin

2013-05-31）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（2009A144）

321000 金華市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科（陳慧君）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（王瑞麗、戴元榮）

戴元榮，E-mail：daiyr@126.com