吳芳 余勝 芮韜 何琦文 錢曉宇 何徐軍 陶厚權(quán) 馬英玉 趙仲生葉再元

●論 著

ARID2在胰腺癌組織中表達(dá)的臨床研究

吳芳 余勝 芮韜 何琦文 錢曉宇 何徐軍 陶厚權(quán) 馬英玉 趙仲生葉再元

目的探討ARID2在胰腺癌與癌旁組織中的表達(dá)情況及其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)SP法,檢測(cè)60例胰腺腺癌及其癌旁組織中ARID2的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果ARID2主要表達(dá)于細(xì)胞核。胰腺癌組織中ARID2陽性表達(dá)19例（31．7%），癌旁正常組織中ARID2陽性表達(dá)46例（76．7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。胰腺癌組織中ARID2的表達(dá)與腫瘤分化程度、分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（均P＜0．05），但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無相關(guān)性（均P＞0．05）。結(jié)論ARID2在胰腺癌中低表達(dá)，且其表達(dá)程度與胰腺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，提示其可能在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用，是胰腺癌預(yù)后的良好指標(biāo)，可為臨床診治提供一定的參考依據(jù)。

胰腺癌 ARID2 預(yù)后

胰腺癌惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差，占全球癌癥死亡原因的第四位，其5年生存率低于5%，且近50年來無明顯改善[1]。胰腺癌的起病較隱匿，確診的胰腺癌患者中僅約20%的腫瘤較局限可以行外科切除，近80%則因發(fā)生轉(zhuǎn)移等無法切除[2]。行手術(shù)切除并輔以化療的胰腺癌患者，術(shù)后平均存活12～22個(gè)月，其5年生存率為20%～25%[3]。近年來的研究表明，胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多階段過程，與癌基因表達(dá)失?；蛞职┗蚴Щ钣嘘P(guān)，其中染色質(zhì)重塑復(fù)合物的突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。AT-rich interactive domain 2（ARID2）是從P月AF（一種參與依賴配體的核受體轉(zhuǎn)錄激活的SWI/ SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物）中被分離鑒定的[5]，作為抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如在肝癌、肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了其失活突變。然而，ARID2與胰腺癌相關(guān)性的研究較少，在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ARID2在胰腺癌與癌旁組織中的表達(dá)情況，旨在探討ARID2在胰腺癌組織中的表達(dá)及意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2006-01—2013-01在浙江省人民醫(yī)院接受手術(shù)并切除的胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本各60例，均經(jīng)常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)明確診斷，術(shù)前未作化療、放療。胰腺癌患者中男28例，女32例，年齡35～88（62.82±11.76）歲；按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）胰腺癌TNM分期（2010版）：Ⅰ期7例，Ⅱ期25例，Ⅲ期2例，Ⅳ期26例；分化程度：高分化12例，中分化26例，低分化22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移26例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移34例。

1.2 主要試劑 小鼠抗人ARID2單克隆抗體 [購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，ARID2（E-3）：sc-166117]；即用型免疫組化超敏SP試劑盒（SP-9000）和二氨基聯(lián)苯胺（DA月）顯色劑（均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 免疫組化染色 石蠟包埋組織連續(xù)切片，厚度為4μm，60℃烤片2h，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水浸泡，高壓鍋抗原修復(fù)3min。室溫下冷卻30min，3%H2O2室溫下孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，P月S漂洗3min×3次。滴加試劑A（藍(lán)色液體）室溫孵育15min，傾去，勿洗。滴加稀釋度為1：50的ARID2抗體（稀釋劑為P月S）；陽性對(duì)照為已知陽性的胰腺癌組織，以P月S代替一抗作陰性對(duì)照。4℃冰箱中過夜。第2天取出后P月S漂洗3min×3次，滴加試劑月（黃色液體），室溫孵育15min，P月S漂洗3min×3次。滴加試劑C（橙色液體）室溫孵育15min，P月S漂洗3min× 3次，DA月顯色3min左右，蒸餾水漂洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色情況進(jìn)行判斷。ARID2主要在細(xì)胞核表達(dá)，根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比例綜合計(jì)分，細(xì)胞的染色強(qiáng)度可分為0分（染色陰性）、1分（淡黃色顆粒）、2分（棕黃色顆粒）、3分（褐色顆粒）；陽性細(xì)胞比例評(píng)分方法：0分（陽性細(xì)胞比例≤5%）、1分（5%＜陽性細(xì)胞比例≤25%）、2分（25%＜陽性細(xì)胞比例≤50%）、3分（50%＜陽性細(xì)胞比例≤75%），4分（75%＜陽性細(xì)胞比例≤100%）。根據(jù)兩項(xiàng)乘積的分?jǐn)?shù)分類，分?jǐn)?shù)≤4記為ARID2表達(dá)陰性，分?jǐn)?shù)＞4記為ARID2表達(dá)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ARID2在胰腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況 ARID2主要表達(dá)于細(xì)胞核。胰腺癌組織中ARID2陽性表達(dá)（圖1）19例（31.7%），癌旁正常組織中ARID2陽性表達(dá)（圖2）46例（76.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 ARID2在胰腺癌組織的表達(dá)情況（A：SP法，×200；B：SP法，×400）

圖2 ARID2在胰腺癌旁正常組織中的表達(dá)（A：SP法，× 200，B：SP法，×400）

2.2 胰腺癌組織中ARID2的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。

由表1可見，胰腺癌組織中ARID2的表達(dá)與腫瘤分化程度、分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（均P＜0.05），但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無相關(guān)性（均P＞0.05）。

3 討論

ARID2屬于ARID家族，是從一種參與依賴配體的核受體轉(zhuǎn)錄激活的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物P月AF中被分離鑒定出來的[5]。SWI/SNF復(fù)合物是一種進(jìn)化保守的多亞單位的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，對(duì)染色質(zhì)重塑起著決定性作用，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量動(dòng)員核小體，使染色質(zhì)重構(gòu)，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，控制多種生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)抑制[6]。越來越多的研究證實(shí)了這種復(fù)合物在腫瘤發(fā)生中的作用，它的幾個(gè)亞單位具有內(nèi)在的腫瘤抑制因子活性，或者是腫瘤抑制基因激活所必須的。

染色質(zhì)重塑通過影響核小體結(jié)構(gòu)，為其他蛋白提供和DNA的結(jié)合位點(diǎn)，是表觀遺傳修飾模式中的一種重要機(jī)制，染色質(zhì)重塑復(fù)合物若發(fā)生突變，可導(dǎo)致染色質(zhì)不能重塑，影響基因的正常表達(dá)，導(dǎo)致疾病發(fā)生。若突變引起抑癌基因或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白出現(xiàn)異常，則可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Gui等[4]推測(cè)，染色質(zhì)重塑異?？赡苁菍?dǎo)致膀胱癌發(fā)生的一個(gè)重要原因，其在97例膀胱移行細(xì)胞癌患者中檢測(cè)到59%的患者含有染色體重塑相關(guān)基因，其中就包括ARID2基因。Fujimoto等[7]對(duì)肝癌的全基因組測(cè)序也發(fā)現(xiàn)，約50%的腫瘤中存在ARID2突變。Li等[8]對(duì)129例肝細(xì)胞肝癌患者外顯子組測(cè)序并對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其中18.2%攜帶有丙型肝炎病毒的肝細(xì)胞肝癌患者的染色質(zhì)重塑基因ARID2發(fā)生了失活性突變。推測(cè)其可能原因?yàn)椋珹RID2的鈍化突變可抑制干擾素-α誘導(dǎo)的Jak-STAT信號(hào)肽，進(jìn)而促使慢性丙肝向HCV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)化。另外，在肺癌及黑色素瘤中也發(fā)現(xiàn)了ARID2的失活性突變[9-10]。以上說明，ARID2基因失活性突變與多種腫瘤的形成密切相關(guān)。在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中，月iankin等[11]利用基因測(cè)序和拷貝數(shù)分析的方法發(fā)現(xiàn)了新的突變基因，其中就包括參與染色質(zhì)重塑的ARID2，但ARID2所起的作用尚不清楚，尤其是其與臨床病理特征的關(guān)系尚未見報(bào)道。

表1 胰腺癌組織中ARID2的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

本研究結(jié)果顯示，ARID2在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織；在胰腺癌組織中ARID2的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位等無明顯相關(guān)性，而與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移與否明顯相關(guān)，這預(yù)示著ARID2的表達(dá)失活可能導(dǎo)致腫瘤惡化及轉(zhuǎn)移。分析其可能原因?yàn)锳RID2發(fā)生突變，導(dǎo)致染色質(zhì)不能重塑，引起抑癌基因或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但是其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。由此可見，ARID2的表達(dá)與胰腺癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，可考慮將其作為評(píng)估胰腺癌轉(zhuǎn)移潛能及判斷預(yù)后的指標(biāo)之一，也將為胰腺癌的基因靶向治療提供新的思路。

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al．Cancer statistics[J]．CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300．

[2]Butturini G,Stocken D D,Wente M N,et al．Influence of resection margins and treatment on survival in patients with pancreatic cancer:meta-analysis of randomized controlled trials[J]．Arch Surg,2008,143(1):75-83．

[3]Neoptolemos J P,Stocken D D,Bassi C,et al．Adjuvant chemotherapy with fluorouracil plus folinic acid vs gemcitabine following pancreatic cancer resection:a randomized controlled trial[J]．JAMA,2010,304(10):1073-1081．

[4]Gui Y,Guo G,Huang Y,et al．Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder[J]．Nat Genet,2011,43(9):875-878．

[5]Yan Z,Cui K,Murray D M,et al．PBAF chromatin-remodeling complex requires a novel specificity subunit,BAF200,to regulate expression of selective interferon-responsive genes[J]．Genes Dev,2005,19(14):1662-1667．

[6]Reisman D,Glaros S,Thompson E A．The SWI/SNF complex and cancer[J]．Oncogene,2009,28(14):1653-1668．

[7]Fujimoto A,Totoki Y,Abe T,et al．Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators[J]．Nat Genet, 2012,44(7):760-764．

[8]Li M,Zhao H,Zhang X,et al．Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene ARID2 in hepatocellular carcinoma[J]．Nat Genet,2011,43(9):828-829．

[9]Manceau G,Letouze E,Guichard C,et al．Recurrent inactivating mutations of ARID2 in non-small cell lung carcinoma[J]．Int J Cancer,2013,132(9):2217-2221．

[10]Hodis E,Watson I R,Kryukov G V,et al．A landscape of driver mutations in melanoma[J]．Cell,2012,150(2):251-263．

[11]Biankin A V,Waddell N,Kassahn K S,et al．Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes [J]．Nature,2012,491(7424):399-405．

Clinical study on expression of ARID2 in pancreatic carcinoma

ObjectiveTo examine the expression level of ARID2 in pancreatic cancer and analyze its relationship with clinicopathological features of pancreatic cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect ARID2 expression in 60 pancreatic cancer tissue and tumor-adjacent tissue specimens．The correlation between ARID2 and clinicopathological features of pancreatic cancer was analyzed．ResultsThe positive rate of ARID2 expression was significantly lower in pancreatic cancer than in tumor-adjacent tissue(31．7%vs 76．6%,P＜0．05)．ARID2 expression was negatively correlated with tumor stage,differentiation,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05),but showed no significant correlation with sex,age,tumor size and location(P＞0．05)．ConclusionDown-regulation of ARID2 expression in pancreatic cancer may contribute to tumor metastasis and development．ARID2 might be a marker for favorable prognosis as a tumor suppressor,which may provide experimental basis for diagnosis and treatment of pancreatic cancer．

Pancreatic cancer ARID2 Prognosis

2013-09-04）

（本文編輯：歐陽卿）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81071991、81372598）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院胃腸外科（吳芳、余勝、芮韜、何琦文、錢曉宇、陶厚權(quán)、葉再元），病理科（趙仲生），浙江省胃腸病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（何徐軍、馬英玉）

葉再元，E-mail：zaiyuanye@163.com