費(fèi)正華 陳云亮 馬勝林

細(xì)梗香草總皂苷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H460凋亡及其機(jī)制的研究

費(fèi)正華 陳云亮 馬勝林

目的 觀(guān)察細(xì)梗香草總皂苷（LC）對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 在H460肺癌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入不同濃度的LC，采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，AnnexinⅤ/PI（FCM）法觀(guān)察LC對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用和周期分布的影響。DCFH-DA熒光探針FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成，Western blot法檢測(cè)NF-κB、I-κB、Bax、Bcl-2、Capase-3的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 LC可抑制H460細(xì)胞生長(zhǎng)，具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性；LC作用H460細(xì)胞后克隆形成率明顯下降。LC可引起H460細(xì)胞凋亡，并可將H460生長(zhǎng)阻滯在S期。LC以濃度依賴(lài)方式增高H460細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，還可使H460細(xì)胞I-κB、Bax和Capase-3表達(dá)增加，而使NF-κB和Bcl-2表達(dá)降低。結(jié)論 LC可以抑制H460細(xì)胞增殖，可能是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)，激活了肺癌細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑。

細(xì)梗香草 肺癌 凋亡 活性氧

非小細(xì)胞肺癌惡性程度高，在腫瘤相關(guān)死亡原因中排首位[1]。許多患者初診時(shí)即為晚期，因此失去手術(shù)機(jī)會(huì)。以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的第三代化療藥物在非選擇性的晚期非小細(xì)胞肺癌中總體有效率為30%～40%，帶來(lái)的生存獲益有限，且存在一定的毒副反應(yīng)[2]。尋找新的高效低毒的藥物是肺癌治療重要的研究方向。祖國(guó)傳統(tǒng)中草藥在腫瘤治療中具有增效減毒的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但對(duì)具體的藥效機(jī)制等基礎(chǔ)研究相對(duì)缺乏[3-4]。本文旨在研究細(xì)梗香草（Lysimachia capilliposide hemsl）提取物總皂苷（Capilliposide，LC）對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株H460由上海生物細(xì)胞庫(kù)提供。LC由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶由美國(guó)GI月CO公司提供；新生小牛血清（FCS）由杭州四季青生物科技有限公司提供；MTT由美國(guó)Sigma公司提供；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒和月CA定量試劑盒由南通碧云天生物科技有限公司提供；細(xì)胞凋亡和周期檢測(cè)試劑盒由杭州聯(lián)科生物公司提供，抗體NF-κ月、I-κ月，Capase-3由美國(guó)Santa Cruz公司提供，月ax、月cl-2及相應(yīng)二抗由美國(guó)CST公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 將H460細(xì)胞以2.0×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃過(guò)夜。將細(xì)胞分觀(guān)察組和對(duì)照組。觀(guān)察組分別加入0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/ ml的LC。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。采取MTT法檢測(cè)，加入1mg/ml的MTT溶液100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄上清液，加入150μl/孔酸化異丙醇，振蕩10min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔D490值，計(jì)算H460細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=觀(guān)察組D490/對(duì)照組D490×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H460細(xì)胞，消化接種于培養(yǎng)皿，每皿加入9ml含500個(gè)H460細(xì)胞的培養(yǎng)液。分3組加入0、2、4μg/ml LC，每組重復(fù)3次。培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d，棄培養(yǎng)液后P月S洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定10min，P月S洗滌細(xì)胞3次，用結(jié)晶紫染色液染色10min，雙蒸水洗滌后，將計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞克隆并拍照。1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞的初濃度至（2.0×105）個(gè)/ ml加入6孔板,分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞,以70%乙醇固定24h后P月S液洗滌2次,離心（離心半徑30cm，500r/min，離心5min）后棄上清液。分別加入5μl AnnexinV-FITC和10μl碘化丙啶（PI），混勻。在室溫下，避光反應(yīng)5～15min檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，再加入10μl PI,混勻，檢測(cè)細(xì)胞周期分布，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞的初濃度至（2.0×105）個(gè)/ ml加入6孔板,分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h,收集細(xì)胞。加入 10μmol/L DCFH-DA孵育2～3 h，然后用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基洗滌3次，流式細(xì)胞儀用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀以488 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞的初濃度至（2.0×105）個(gè)/ml加入6孔板，分3組加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞提取總蛋白，月CA法測(cè)定蛋白濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠。每孔加入100μg樣品進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉液封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗（1∶1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，T月ST洗膜3次，選擇辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗（1∶500稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光顯色。月and Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示。兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LC對(duì)H460細(xì)胞增殖的影響 不同濃度LC分別作用H460細(xì)胞24、48、72h，其中1～32μg/ml濃度LC對(duì)H460細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性抑制。LC作用24h和48hH460細(xì)胞IC50分別為2.85μg/ml、2.08μg/ml（圖1）。根據(jù)IC50結(jié)果，選取2、4μg/ml濃度的LC進(jìn)行作用機(jī)制方面的研究。

圖1 不同濃度LC對(duì)H460細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460細(xì)胞24h后接種于培養(yǎng)皿，繼續(xù)克隆培養(yǎng)14d后，克隆形成數(shù)分別為（403.6±40.9）個(gè)、（292.3±26.4）個(gè)和（92.6±10.7）個(gè)。觀(guān)察組細(xì)胞集落形成能力明顯弱于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 LC作用H460細(xì)胞后克隆形成能力

2.3 LC對(duì)肺癌H460細(xì)胞周期和凋亡的影響 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460細(xì)胞24h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡率分別為（2.2±0.3）%、（21.5±3.2）%和（19.8±2.9）%，晚期凋亡率分別為（1.3±0.1）%、（15.9± 2.6）%和（28.9±3.4）%，與對(duì)照組比較，LC的早晚期凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖3。不同給藥濃度觀(guān)察組的H460細(xì)胞的S期細(xì)胞比例增多,G1/G0期和G2/M期細(xì)胞比例減少，早晚期凋亡率均增高。0、2、 4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細(xì)胞24h后S期細(xì)胞的比例分別為（12.35±1.72）%、（34.75±4.15）%和（44.02± 5.02）%，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.4 LC對(duì)肺癌H460細(xì)胞ROS的影響 見(jiàn)圖5。

圖3 LC作用于H460細(xì)胞凋亡率的改變

圖4 LC作用于H460細(xì)胞S期細(xì)胞比例的改變

圖5 LC作用于H460細(xì)胞ROS的改變

由圖5可見(jiàn)，2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細(xì)胞 3h后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別為（15.81±2.1）%和（32.54±5.7）%。與對(duì)照組[（3.07±0.5）%]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.5 LC對(duì)肺癌H460細(xì)胞對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blot檢測(cè)0、2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460細(xì)胞24h后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。2、4 μg/ml組與對(duì)照組比較，蛋白I-κ月、月ax和 Capase-3表達(dá)增加，而NF-κ月和月cl-2表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），見(jiàn)圖6、表1。

表1 LC（0、2、4μg/ml）作用于肺癌H460細(xì)胞24h凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖6 LC作用H460細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的改變情況

3 討論

目前，尋找天然的抗腫瘤化合物依然是研制抗腫瘤新藥的一個(gè)重要策略。在既往抗腫瘤藥物研發(fā)過(guò)程中，超過(guò)60%為天然藥物或者是以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)的合成和半合成衍生物[5]。細(xì)梗香草又名滿(mǎn)山香，為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，主要分布于我國(guó)華南地區(qū)，民間多用于治療感冒咳嗽、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)及抗腫瘤等。田景奎教授等采用HPLC-ELSD法提取了LC，主要包括皂苷月和皂苷C兩種成分[6-7]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)LC對(duì)前列腺癌、胃癌、卵巢癌等具有較好抗腫瘤活性，但其在非小細(xì)胞肺癌中作用及具體機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。本文通過(guò)LC作用肺癌H460細(xì)胞，研究其對(duì)肺癌增殖、凋亡的影響，并初步研究相關(guān)機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在特定基因控制下的自主性死亡過(guò)程，體內(nèi)腫瘤的發(fā)生是由于機(jī)體組織細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制失調(diào)而引起的，細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中藥及其提取物對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用往往與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)LC對(duì)肺癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。進(jìn)一步流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率發(fā)現(xiàn)，不同濃度LC作用肺癌細(xì)胞24h發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞凋亡比例明顯上升，早晚期凋亡均明顯。細(xì)胞周期是生命活動(dòng)的基本過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)存在一系列監(jiān)控機(jī)制確保細(xì)胞周期各時(shí)相轉(zhuǎn)化有序進(jìn)行，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的進(jìn)程是密切相關(guān)的，當(dāng)DNA受損或復(fù)制不完全時(shí)細(xì)胞周期將停留于某一時(shí)相，待DNA修復(fù)或復(fù)制完全后方可進(jìn)入下一時(shí)相，若DNA不能修復(fù)或不能完全復(fù)制則啟動(dòng)凋亡機(jī)制引起細(xì)胞凋亡。姜黃素可以引起LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并使癌細(xì)胞阻滯在S期[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LC作用肺癌細(xì)胞后S期細(xì)胞比例明顯上升，H460細(xì)胞大量在S期堆積，阻止了向G2/M期的轉(zhuǎn)變，減緩癌細(xì)胞有絲分裂過(guò)程，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速凋亡。

ROS是體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物，在真核細(xì)胞有氧呼吸過(guò)程中形成的，是重要的信號(hào)分子[13]。腫瘤細(xì)胞通常含有較高水平的ROS，維持腫瘤生長(zhǎng)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)激活。但同時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)較高水平的ROS也使其在受到各種攻擊時(shí)，比正常細(xì)胞更易于死亡[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LC作用肺癌細(xì)胞3h后ROS達(dá)峰值，低濃度組，高濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROS可以通過(guò)激活多種細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)周期，如YAP,NOX1等。在前面研究中我們也觀(guān)察到肺癌細(xì)胞被LC阻滯在S期，與其他文獻(xiàn)結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)ROS的激活能降低線(xiàn)粒體跨膜電勢(shì)，開(kāi)放線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)變并釋放線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C，并能通過(guò)抑制氧化半胱氨酸殘基降解來(lái)減少對(duì)I-κ月的激活，使NF-κ月通路轉(zhuǎn)錄受到抑制[15]。研究表明NF-κ月是調(diào)控多種基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]，該通路能調(diào)節(jié)下游多種腫瘤增殖及凋亡相關(guān)蛋白，如月cl-2，月ax，月ad，CytoC蛋白等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，2μg/ml和4μg/ml LC作用H460細(xì)胞后抑制了NF-κ月通路。與對(duì)照組比較，NF-κ月表達(dá)降低，I-κ月表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，凋亡促進(jìn)蛋白月ax和Capase-3酶表達(dá)明顯增加，凋亡抑制蛋白月cl-2表達(dá)降低。月cl-2家族被認(rèn)為在線(xiàn)粒體凋亡通路中起關(guān)鍵作用[18]。月cl-2表達(dá)降低，而Cyto-C，月ax表達(dá)增加，可激活凋亡執(zhí)行蛋白，Capase-3酶。這些蛋白的激活或被抑制，最終激活啟動(dòng)凋亡信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)DNA片段碎片，核固縮等典型凋亡特征。

LC通過(guò)促進(jìn)H460細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖，可能與LC使肺癌細(xì)胞被阻滯在S期，無(wú)法進(jìn)行有絲分裂相關(guān)。另外，我們觀(guān)察到LC作用H460細(xì)胞后，肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高，抑制了NF-κ月通路，促進(jìn)了下游促凋亡蛋白月ax的表達(dá)，抑制了月cl-2蛋白表達(dá)，啟動(dòng)Capase-3酶來(lái)執(zhí)行凋亡命令，最終激活了線(xiàn)粒體凋亡途徑[18]。因此，LC有可能為非小細(xì)胞肺癌治療帶來(lái)新的方法。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A．Cancer statistics,2013[J]．CA Cancer J Clin,2013,63(1)：11-30．

[2] Lam K C,Mok T S．Targeted therapy：an evolving world of lung cancer[J]．Respirology,2011,16(1)：13-21．

[3] 曹洋．晚期非小細(xì)胞肺癌的中醫(yī)證候規(guī)律研究[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(4)：754-757．

[4] Hsiao W L,Liu L．The role of traditional Chinese herbal medicines in cancer therapy——from TCM theory to mechanistic insights[J]．Planta medica,2010,76(11)：1118-1131．

[5] Amiri-Kordestani L,Basseville A,Kurdziel K,et al．Targeting MDR in breast and lung cancer：discriminating its potential importance from the failure of drug resistance reversal studies[J]．Drug Resist Updat,2012,15(1-2)：50-61．

[6] Liang B,Zhang L,Tian J,et al．Isolation and characterization of two new saponins from Lysimachia capillipes[J]．Carbohydr Res, 2006,341(14)：2444-2448．

[7] Tian J K,Xu L Z,Zou Z M,et al．Two new triterpene saponins from Lysimachia capillipes[J]．J Asian Nat Prod Res,2006,8(5)：439-444．

[8]應(yīng)弘梅,戚中杰,郭達(dá)偉,等．HPLC-ELSD測(cè)定細(xì)梗香草皂苷B與皂苷C的含量[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志,2011,46(9)：704-706．

[9] 徐燕,榮語(yǔ)媚,劉小保,等．細(xì)梗香草總皂苷的抗腫瘤活性研究[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(4)：545-549．

[10] Fang Y,Yu Y,Hou Q,et al．The Chinese herb isolate isorhapontigenin induces apoptosis in human cancer cells by down-regulating overexpression of antiapoptotic protein XIAP [J]．J Biol Chem,2012,287(42)：35234-35243．

[11] 周小紅,徐飛龍,陳建．吉西他濱聯(lián)合槲皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響研究[J]．浙江醫(yī)學(xué),2013,35(7)：542-546．

[12] Guo L D,Chen X J,Hu Y H,et al．Curcumin inhibits proliferation and induces apoptosis of human colorectal cancer cells by activating the mitochondria apoptotic pathway[J]．Phytother Res,2013,27(3)：422-430．

[13] Trachootham D,Alexandre J,Huang P．Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms：a radical therapeutic approach[J]．Nat Rev Drug Discov,2009,8(7)：579-591．

[14] Wang J,Yi J．Cancer cell killing via ROS：to increase or decrease,that is the question[J]．Cancer Biol Ther,2008,7(12)：1875-1884．

[15] Gao X,Deeb D,Liu P,et al．Role of reactive oxygen species (ROS)in CDDO-Me-mediated growth inhibition and apoptosis in colorectal cancer cells[J]．J Exp Ther Oncol,2011,9(2)：119-127．

[16] Cooks T,Pateras I S,Tarcic O,et al．Mutant p53 Prolongs NF-kappaB Activation and Promotes Chronic Inflammation and Inflammation-Associated Colorectal Cancer[J]．Cancer Cell,2013,23(5)：634-646．

[17]Dong X,Li J C,Jiang Y Y,et al．p38-NF-kappaB-promoted mitochondria-associated apoptosis and G2/M cell cycle arrest in norcantharidin-treated HeLa cells[J]．J Asian Nat Prod Res, 2012,14(11)：1008-1019．

[18] Li Y,Zhang S,Geng J X,et al．Curcumin inhibits human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation through regulation of Bcl-2/Bax and cytochrome C[J]．Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(8)：4599-4602．

Capillipes inhibits proliferation and induces apoptosis of human lung cancer H460 cells

ObjectiveTo investigate the effect of capilliposides isolated from Lysimachia capillipes Hemsl(capillipes,LC) on proliferation and apoptosis of human non-small lung cancer cell line H460 in vitro．Methods H460 cells were cultured with different concentration of LC．The proliferation,colony formation and cell cycle of H460 cells were measured by MTT method, colony formation assay and flow cytometry,respectively．Intracellular reactive oxygen species(ROS)was measured by FCM with fluorescent probe of DCFH-DA．The expression of signal transduction proteins NF-κB,I-κB,Bax,Bcl-2 and capase-3 was detected by Western blotting．Results The proliferation of H460 cells was inhibited and the ability of colony-formation was reduced;the apoptosis rate of H460 cells was increased（P＜0．05）and the cell cycle was arrested at S phase（P＜0．05）after cultured with LC for 24h．LC significantly increased ROS level in H460 cells in a concentration-dependent manner．LC up-regulated I-κB and Bax expression，and activated capase-3 enzyme（P＜0．05）while the expression levels of NF-ΚB and Bcl-2 were down-regulated（P＜0．05）．Conclusion LC can inhibit the growth and induce apoptosis of H460 cells,which may be associated with ROS generation and activation of mitochondrial apoptotic pathway．

Capilliposide Lung cancerApoptosis ROS

2013-05-27）

（本文編輯：楊麗）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科（費(fèi)正華為浙江中醫(yī)藥大學(xué)在讀博士生）；溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院腫瘤科（陳云亮）

馬勝林，E-mail：mashenglin@medmail.com.cn