胡志斌 嚴志焜 王海濤 孟群 潘曉華

灌注保存對豬離體供心冠脈和心肌保護效果的研究

胡志斌 嚴志焜 王海濤 孟群 潘曉華

目的 觀察不同保存方法及不同灌注容量對豬離體供心冠脈血管因子表達和心肌細胞保護效果的影響。 方法 巴拿馬小型香豬共36只，根據(jù)保存技術(shù)不同分為浸泡保存組和間斷灌注保存組，間斷灌注容量分別為50、100、150、200、250ml，每組6只。灌注液為30μmol/L二氮嗪強化Celsior液，保存溫度為4℃，時間10h。保存后比較各組間冠脈血管中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、細胞黏附分子-1（ICAM-1）表達情況，以及心肌細胞凋亡情況、心肌組織ATP含量（ATPC）、心肌含水量（MWC）。 結(jié)果 間斷灌注保存各組較浸泡保存組能維持較高的ATP水平，減少心肌細胞凋亡，降低MWC；而eNOSmRNA表達量高于浸泡保存組，ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達量卻低于浸泡保存組（P＜0．05）。當灌注容量為50～200ml時，隨著灌注容量的增加，ATPC和eNOSmRNA表達量逐漸增高，凋亡指數(shù)、MWC、ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達量則逐漸降低；繼續(xù)增加灌注容量至250ml時，各指標并無顯著變化。 結(jié)論 在長時間心臟保存中，每隔2h灌注1次，每次灌注容量為200ml能較好保護供心；當灌注容量低于200ml時，隨著灌注容量的增加供心保護效果逐漸增強，且對冠脈和心肌的保護作用具有等同性。

灌注保存 內(nèi)皮細胞血管因子 心肌保護

近年來，學者們普遍認為間斷灌注保存較持續(xù)灌注保存對心肌的保護作用更好[1-2]。如何使間斷灌注保存對心肌保護的作用達到最佳，關(guān)鍵在于掌握適宜的灌注壓力、流速、時間等參數(shù)。心臟移植供心的保護包含心肌細胞保護和血管細胞（內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞）保護，在心臟保存期間，應用同一種保存技術(shù)對供心心肌和血管細胞的保護作用是否等同，亦仍未明了。因此，筆者利用二氮嗪強化Celsior液，比較不同保存方法和不同灌注容量（間接反映灌注壓力和流速）間斷灌注進行豬離體供心心肌和血管保護效果的差異，以期提高供心保存質(zhì)量，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 二氮嗪強化Celsior液由本室配制，用于心臟的停搏和灌注保存，其配制成分及含量（mmol/L）：二氮嗪30、Na+100、K+15、Cl-41.5、Mg2+13、Ca2+0.25、甘露醇60、乳糖酸80、組氨酸30、谷氨酸20、還原型谷胱甘肽3，pH 7.4，滲透壓320mOsm/L。所需試劑均購自上海思域化工科技有限公司。二氮嗪為美國Sigma公司產(chǎn)品。Tunel細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR測定試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 建立模型 巴拿馬小型香豬共36只，體重30～35kg，由浙江醫(yī)學科學研究院提供。實驗豬麻醉前12h禁食，但不禁水。氯胺酮15mg/kg聯(lián)合咪唑安定1mg/kg肌肉注射麻醉，氣管插管輔助通氣。3mg/kg全身肝素化后，正中開胸暴露心臟，將停搏液灌注管置于主動脈根部，阻斷升主動脈，二氮嗪強化Celsior液灌注心臟，灌注流量30ml/kg，灌注時間5min，致使停搏。迅速切斷各動靜脈血管，摘取供心，置4℃二氮嗪強化Celsior液中保存。根據(jù)供心保存技術(shù)分為6組：（1）浸泡保存組（6只）：供心取出后靜置保存于4℃二氮嗪強化Celsior液中10h，隨后取出制取標本；（2）灌注保存組：供心取出后保存于4℃二氮嗪強化Celsior液中10h，期間每隔2h灌注4℃二氮嗪強化Celsior液1次，30 min/次；根據(jù)間斷灌注容量分為50、100、150、200和250ml灌注保存組（各組6只），隨后取出制取標本。

1.3 實驗檢測指標及測定方法

1.3.1 冠脈血管內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、內(nèi)皮素1（ET-1）、細胞黏附分子（ICAM-1）檢測 各組留取冠脈左前降支血管2mm置冰浴勻漿器中，加入Trizol進行Total RNA提取，SY月R Green Assay體系進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，以及MX3000PPCR擴增儀進行熒光定量檢測eNOS、ET-1和ICAM-1指標的相對mRNA表達量。

1.3.2 心肌組織凋亡指標 各組留取一小塊左心室前壁心肌為標本，采用原位末端標記法測定心肌細胞凋亡情況，并計算心肌細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。心肌組織ATP含量（ATPC）：留取小塊左心室肌組織，立即投入液氮中凍存；采用ATP檢測試劑盒進行免疫熒光法測定，通過標準曲線計算出樣本中ATPC。心肌含水量（myocardial water content，MWC）：留取小塊左心室肌組織，用濾紙拭干，稱取濕重后置80℃烘箱中烘烤48h，再稱取心肌干重。MWC=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

灌注保存組eNOSmRNA表達量高于浸泡保存組，ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達低于浸泡保存組；當灌注容量為50～200ml時，隨著灌注容量的增加，eNOSmRNA表達量逐漸增高，ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達量逐漸降低；繼續(xù)增加灌注容量為250ml時，各指標無顯著性變化。其中50ml灌注組與100ml灌注組eNOSmRNA表達量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；150、200與250ml灌注組ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。浸泡保存組心肌細胞凋亡最多，ATPC最少，MWC最多。200ml和250ml灌注組心肌細胞凋亡較少，ATPC較高，心肌水腫程度較輕，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與50、100、150ml灌注組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組相關(guān)檢測指標的比較

3 討論

心臟移植時，供體心臟保護的好壞直接影響心臟移植的效果。本研究保存液采用二氮嗪強化Celsior液，是一種添加ATP敏感性鉀離子通道開放劑——二氮嗪（30μmol/L）的Celsior液，曾被認為具有良好的心肌保護效果[3]；保存技術(shù)選擇不同容量的間斷灌注保存與持續(xù)浸泡保存，分析其在血管內(nèi)皮和平滑肌保護作用的差異。研究結(jié)果顯示，灌注保存對供心在心肌和血管細胞上的保護作用優(yōu)于持續(xù)浸泡保存；在50～200ml間斷灌注容量保存時，隨著灌注容量的逐漸增加，心肌ATPC儲備和eNOSmRNA表達量逐漸增高；心肌細胞凋亡逐漸減少，心肌水腫程度逐漸減輕，ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達逐漸降低；繼續(xù)增加灌注容量至250ml時，心肌ATPC儲備和eNOSmRNA表達并未顯著增多；心肌細胞凋亡、水腫未顯著減輕，ET-1mRNA和ICAM-1mRNA表達量亦未顯著降低，說明灌注容量為200ml時，能較好地保護心肌細胞，以及血管舒張功能和抑制炎性介質(zhì)的釋放。

心臟移植過程中，供心將遭受獲取期的熱缺血、暫存期的冷缺血及移植后的缺血再灌注等階段的損傷，其中供心暫存期的損傷程度受人為因素影響較明顯，因此在暫存期盡量維持心臟正常營養(yǎng)的供給及代謝產(chǎn)物的排出至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，采用低溫、間斷灌注二氮嗪強化Celsior液的保存方法可減輕冷缺血損傷，使供心心肌細胞和血管細胞功能都得到優(yōu)質(zhì)的保護，其可能原因如下：首先，低溫降低了心肌代謝率，減少了氧耗和能耗[4-5]，同時冠狀動脈內(nèi)皮也能較好地耐受低溫[6]。器官保存液——Celsior液是心臟專用保存液，該保存液中鉀含量低，能避免冠脈血管的損傷[7-8]。二氮嗪是線粒體敏感性鉀離子通道開放劑，將其加入Celsior液具有維持細胞內(nèi)ATP濃度、保護線粒體的功能；減少心肌酶漏出，降低活性氧產(chǎn)生，以及較少發(fā)生再灌注后心律失常和心肌收縮功能異常等作用[3，9]，可使冠狀動脈血管平滑肌細胞膜超極化，促進心臟停搏后的血管舒張功能等[10]。再者，間斷灌注保存技術(shù)提供了適宜的能量底物以及帶走相應的有害代謝產(chǎn)物，同時減輕了持續(xù)灌注保存中心肌細胞水腫和血管內(nèi)皮損傷的程度。30min內(nèi)給予50～200ml的灌注容量，其流量介于Wicomb等[11]報道的0.002～0.004ml/（g·min）微流量灌注和Rosenbaum等[12]報道的0.1ml/（g·min）低流量灌注之間，心臟保存效果均良好。在200ml的灌注容量以內(nèi)，隨著灌注容量的增加，血管內(nèi)皮感受血流剪切應力和靜水壓力等生物力學的變化，并沒有引起過分調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)，如刺激細胞因子、一氧化氮合成酶的釋放，從而介導炎性介質(zhì)的表達等，進而引起內(nèi)皮細胞功能障礙或異常增值[13]，而是隨著容量的增加更好地維持了心肌細胞ATP含量，減少了心肌細胞凋亡，降低了無氧酵解代謝產(chǎn)物和炎性介質(zhì)對血管內(nèi)皮的損害。當增加灌注容量至250ml時，與200ml灌注容量心臟保護效果相當，并未見顯著增強或加重損害。但繼續(xù)增加灌注容量，達到或超過Peltz等[14]報道的較大流量灌注15ml/（g·min）時，心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞的保護作用是否同步增強可能值得進一步探討。

綜上所述，長時間心臟保存，間斷灌注保存具有較好地供心保護作用，且每隔2h灌注1次，每次灌注容量為200ml時心肌細胞保護作用最好，血管細胞的保護作用也最佳。

[1]Rivard A L,Hellmich C,Swingen C M,et al．Intermittent antegrade cardioplegia：isolated heart preservation with the Asporto heart preservation device[J]．Prog Transplant,2008,18(2)：127-133．

[2] Nameki T,Takeyoshi I,Oshima K,et al．A comparative study of long-term heart preservation using 12-h continuous coronary perfusion versus 1-h coronary perfusion following 11-h simple immersion[J]．J Surg Res,2006,135(1)：107-112．

[3]Yan Z K,Hu Z B,Pan X H,et al．Diazoxide supplemented Celsior solution improves hypothermic heart preservation effect in rat through activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel[J]．Pharmaceutical Biology,2009,47(11)：1060-1066．

[4] Lima M L,Fiorelli A I,Vassallo D V,et al．Deleterious effect of hypothermia in myocardial protection against cold ischemia：a comparative study in isolated rat hearts[J]．Transplant Proc,2012,44 (8)：2326-3232．

[5]Drescher C,Diestel A,Wollersheim S,et al．How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia[J]?Eur J Cardiothorac Surg,2011,40(2)：352-359．

[6] Iwaki H,Sakamoto A,Tanaka S．Effects of temperature and preservation time on the pharmacological response of isolated vascular endothelial and smooth muscle function[J]．Nihon Ika Daigaku Zasshi,1999,66(1)：15-20．

[7]Oberleithner H,Callies C,Kusche-Vihrog K,et al．Potassium softens vascular endothelium and increases nitric oxide release[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(8)：2829-2834．

[8]He F J,Marciniak M,Carney C,et al．Effects of potassium chloride and potassium bicarbonate on endothelial function,cardiovascular risk factors,and bone turnover in mild hypertensives[J]．Hypertension,2010,55(3)：681-688．

[9]郭煒,沈岳良,陳瑩瑩,等．二氮嗪在長時程心臟低溫保存中的作用[J]．生理學報,2004,56(5)：632-638．

[10] Coetzee W A．Multiplicity of effectors of the cardioprotective agent,diazoxide[J]．Pharmacol Ther,2013,140(2)：167-175．

[11]Wicomb W N,Collins G M．24-hour rabbit heart storage with UW solution．Effects of low-flow perfusion,colloid,and shelf storage [J]．Transplantation,1989,48(1)：6-9．

[12]Rosenbaum D H,Peltz M,DiMaio J M,et al．Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation：effects on myocardial function and metabolism[J]．J Heart LungTransplant,2008,27(1)：93-99．

[13]Desrois M,Caus T,Belles P M,et al．Limitation of myocardial and endothelial injury of the rat heart graft after preservation with Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale (CRMB)solution[J]．Transpl Int,2008,21(3)：276-283．

[14]Peltz M,Cobert M L,Rosenbaum D H,et al．Myocardial perfusion characteristics during machine perfusion for heart transplantation[J]．Surgery,2008,144(2)：225-232．

Intermittent perfusion for protection of coronary endothelium and myocardium in isolated pig hearts

ObjectiveTo compare the protective effect of different preservation methods on coronary endothelium and myocardium in isolated pig hearts．Methods Thirty six hearts isolated from Bama-miniature-pigs were divided into 6 groups：one static storage group and 5 intermittent perfusion groups with 6 in each group．Isolated heart in storage group were preserved in Celsior cardioplegia solution enhanced with diazoxide (DE,30μmol/L)at 4℃for 10h;isolated hearts in perfusion groups underwent intermittent perfusion with 50,100,150,200 or 250ml solution respectively,every 2 h for 10 h．Then the samples of left ventricle and left anterior descending coronary artery were taken and apoptotic cardiomyocytes(AI),adenosine triphosphate concentrations(ATPC),myocardial water content(MWC),endothelial nitric oxide synthase(eNOS),endothilin-1(ET-1)and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)were measured．Results Compared with static storage group,the ATPC,eNOSmRNA in perfusion groups were significantly higher and AI,MWC,ET-1mRNA,ICAM-1mRNA were significantly lower．ATPCand eNOSm-RNA were gradually increased and AI,MWC,ET-1mRNA,ICAM-1mRNA were gradually reduced with the perfusion solution increasing in a range of 50ml to 200ml．There were no significant differences between 200ml and 250ml intermittent perfusion group．Conclusion Intermittent perfusion of preservation solution provides better protective effect on myocardium and endothelium of coronary artery in isolated donor hearts．

Intermittent perfusion Endothelium-derived factorMyocardial protection

2013-12-30）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然科學基金項目（LY12H02007）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院浙江省器官移植重點實驗室心臟分室

胡志斌，E-mail：hulinet169@163.com