程忠強 王偉 強化龍 詹曉東

LKB1及VEGF-C在鼻咽癌中的表達及意義

程忠強 王偉 強化龍 詹曉東

目的 探討LKB1及血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)在鼻咽癌中的表達情況及意義。方法選取鼻咽癌患者50例（觀察組），另擇同期鼻咽黏膜慢性炎癥患者50例作為對照組。采用RT-PCR法檢測兩組患者LKB1及VEGF-C mRNA的表達情況，并分析鼻咽癌組織中LKB1及VEGF-C mRNA的表達與臨床病理因素（年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤大?。┑年P系。結(jié)果觀察組患者LKB1 mRNA的表達水平明顯低于對照組，VEGF-C mRNA的表達水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05）。LKB1及VEGF-C mRNA的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期明顯相關（均P＜0．05），而與年齡及腫瘤大小無明顯相關性（均P＞0．05）。鼻咽癌組織中LKB1與VEGF-C的表達呈負相關（r=-0．62，P＜0．05）。結(jié)論鼻咽癌組織中LKB1與VEGF-C的表達呈負相關，LKB1的低表達及VEGF-C的高表達可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。

鼻咽癌 LKB1 血管內(nèi)皮生長因子C

LKB1基因又被稱為STKⅡ基因，是一種保守的抑癌基因，在細胞的生長增殖、能量代謝和細胞極性調(diào)控等方面起重要作用，且被證明作為抑癌基因與多種腫瘤關系密切。該基因與鼻咽癌的關系至今尚不明確。血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）是腫瘤血管生成的生長因子，能夠促進腫瘤細胞的惡性增殖，但能否促進鼻咽癌細胞增殖的研究尚較少。本研究通過聯(lián)合檢測鼻咽癌組織中的LKB1及VEGF-C mRNA的表達情況，旨在探討LKB1、 VEGF-C在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2012-06—12我院收治的鼻咽癌患者50例（觀察組），均為術中切除標本并經(jīng)病理證實為鼻咽低分化鱗癌，術前均未接受化療或放療。其中男39例，女11例，年齡17～74（59±2.1）歲。對照組為同期收治的鼻咽黏膜慢性炎癥患者50例，均為術中切除標本，男37例，女13例，年齡27～71（58±1.8）歲。

1.2 主要儀器及試劑 Applied Biosystems steponel Real-time PCR系統(tǒng)，垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽（北京市六一儀器廠），Thermo公司MK3型酶標儀，BIO-RAD gel DOC…XR+成像系統(tǒng)，T-PER組織總蛋白提取試劑盒（Thermoscientific公司），Trizol RNA提取試劑盒（Invitrogen公司），QuantcDNA第1鏈合成試劑盒和RealMasterMix（SYBRGreen）試劑盒（天根生物科技有限公司），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 方法 采用Trizol提取兩組標本（重約25mg）組織中的總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，0D260/0D280=1.8～2.0，并在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示出清晰的28S和18S兩條rRNA帶，證明提取的RNA完整。cDNA合成反應體系含2μg RNA、2μl dNTP混合液（終濃度為0.25μmol/L），2μl Oligo-dTl5（終濃度為1μmol/L），1μl Quant反轉(zhuǎn)錄酶，加RNase free ddH2O至終體積為20μl，37℃孵育60min。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說明完成RT-PCR。PCR反應體系包括：2.5×Real Master Mix/20×SYBR溶液混合反應液9μl、cDNA溶液2μl、上下引物（終濃度200nmol/L）各2μl，加ddH2O至20μl。LKB1基因PCR反應條件為：95%預變性2min；95℃15s，56℃30s，68℃60s，38個循環(huán)；最后95℃15s，降溫至56℃1min，然后按每15s上升0.3℃～95℃后保持15s。分別收集熒光信號，進行熔解曲線分析。GAPDH基因PCR反應條件為：95℃預變性2min；95℃15s，63℃30s，68℃60s，40個循環(huán)；最后95℃15s，降溫至60℃1min，然后按每15s上升0.3℃～95℃后保持15s。VEGF-C退火溫度為54.8℃，延伸72℃45s，進行32個循環(huán)，最后72℃延伸10min。分別收集熒光信號，進行熔解曲線分析。結(jié)果采用相對定量法計算，基因引物序列、退火溫度見表1。所有PCR擴增產(chǎn)物片段用瓊脂糖凝膠電泳后，采用全自動電泳凝膠成像分析儀取圖，基因表達者出現(xiàn)相應長度的擴增條帶，減弱者則條帶變細或變淡，缺失者則無特異性擴增條帶出現(xiàn)。用Gel-pro Analyzer 4.5凝膠定量分析軟件分析各擴增條帶產(chǎn)物的含量。內(nèi)參GAPDHmRNA在各種組織中表達穩(wěn)定，取目的基因條帶與內(nèi)參條帶光密度值的比值作為目的基因的相對值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，所得計量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，相關關系采用Pearson相關分析。

表1 引物序列及退火溫度

2 結(jié)果

2.1 兩組標本組織中LKB1及VEGF-C mRNA表達情況的比較 見表2。

表2 兩組標本組織中LKB1及VEGF-C mRNA表達情況的比較

由表2可見，觀察組患者LKB1 mRNA的表達水平明顯低于對照組，VEGF-C mRNA的表達水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2 鼻咽癌組織中LKB1及VEGF-C mRNA的表達與臨床病理因素的關系 見表3。

由表3可見，LKB1及VEGF-C mRNA的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期明顯相關（均P＜0.05），而與年齡及腫瘤大小無明顯相關性（均P＞0.05）。

2.3 鼻咽癌組織中LKB1與VEGF-C表達的相關性 鼻咽癌組織中LKB1與VEGF-C的表達呈負相關（r=-0.62，P＜0.05）。

3 討論

1998年，芬蘭學者Hemminki等[1]和德國學者Jenne等[2]成功克隆Peutz-Jeghers綜合征的致病基因，分別命名為LKB1和STKⅡ。LKB1定位于19P13.3，DNA全長2158bp，編碼區(qū)1302bp，包括9個外顯子、1個非編碼外顯子和11個內(nèi)含子，其編碼的LKB1蛋白由433個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為60kDa，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其第44～309位氨基酸為激酶催化區(qū)，N端第38～43位氨基酸殘基是核定位信號序列。Rowan研究表明，人體中幾乎所有的組織均有LKB1 mRNA的表達。本研究結(jié)果顯示，觀察組LKB1的表達水平顯著低于對照組，VEGF-C mRNA的表達水平明顯高于對照組；而且鼻咽癌組織LKB1 mRNA和VEGF-CmRNA的表達呈負相關。

目前，LKB1/VEGF-C參與喉腫瘤發(fā)生的機制尚未完全清楚，但在腫瘤組織中LKB1的缺失/突變表達使其正常生物學功能喪失可能是鼻咽癌的發(fā)生機制之一。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶是一類在細胞內(nèi)廣泛分布的蛋白質(zhì)，其在細胞的多種生命活動中起著非常重要的作用，LKB1的生物學功能主要有：（1）使細胞周期阻滯在G1期、促進細胞凋亡[4-5]，LKB1與p53靶基因p21/WAF1的關系密切，使其在腫瘤細胞凋亡發(fā)生機制上起重要作用；（2）（VEGF-C的表達，LKB1下調(diào)VEGF-C的表達，抑制腫瘤細胞VEGF-C的信號轉(zhuǎn)導，從而抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。LKB1抑制腫瘤分子機制如下：（1）LKB1基因能促進腺癌細胞進入凋亡程序：LKB1可以激活p53靶基因p21/WAF1。LKB1可以穩(wěn)定體內(nèi)p53，與p21/ WAF1激活過程密切相關。研究先后發(fā)現(xiàn)，抑癌基因LKB1可在細胞核內(nèi)與p53基因發(fā)生物理性交聯(lián)，直接或者間接使p53的兩個基因殘基Ser15和Ser392磷酸化[6]，而且這兩個殘基對于LKB1依賴性細胞周期G1期停留是必需的。研究還發(fā)現(xiàn)，LKB1直接參加p21/WAF1啟動過程，以及其它p53的激活啟動，將LKB1基因融合到缺陷型p53（激活位點被敲除）可以提高p21/WAF1的激活。這都說明LKB1確實是在p21/WAF1基因激活過程中扮演著直接作用，通過促進癌細胞進入凋亡程序來抑制癌細胞的增殖。（2）LKB1基因?qū)δ[瘤細胞VEGF的負調(diào)控[7]：在研究肺腺狀細胞癌變分化過程中發(fā)現(xiàn)，LKB1可下調(diào)VEGF的表達，抑制腫瘤細胞VEGF的信號通路的轉(zhuǎn)導。VEGF基因的近端富含GC序列，是轉(zhuǎn)錄因子SP1的順式作用原件，激活的SP1能加強VEGF的生成和表達，且LKB1具有絲-蘇氨酸激酶活性，SP1又是其磷酸化的底物，缺失/突變的LKB1使得SP1磷酸化的轉(zhuǎn)錄活性增強。應用巢式PCR方法[8]，擴增LKB1基因編碼區(qū)、構建LKB1真核表達載體檢測LKB1在腺癌細胞中的表達以及siRNA技術干擾SP1的表達，結(jié)果顯示：SP1參與LKB1基因?qū)EGF-C的表達調(diào)控，證實了LKB1通過負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達來調(diào)控VEGF的表達[9-12]。

本研究結(jié)果顯示，LKB1和VEGF-C在鼻咽癌中的表達呈相反趨勢，LKB1的低表達、VEGF-C的高表達可能與鼻咽癌的腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，下一步可以通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法揭示兩者與腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，LKB1和VEGF-C有望成為鼻咽癌患者診斷和治療新的評估指標，達到與監(jiān)測鼻咽癌EB病毒抗體來判斷患者病情的同樣效果。如果能夠抑制LKB1的突變，維護其正常生物學功能，促使凋亡程序正常，有望在一定程度上阻止鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展，為研制抗腫瘤新藥提供新的有效的分子靶標。

表3 鼻咽癌組織中LKBl及VEGF-C mRNA的表達與臨床病理因素的關系

[1]Hemminki A,Markie D,Tomlinson I,et al．A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome[J]．Nature,1998,391 (6663)：184-187．

[2]Paavonen K,Horelli-Kuitunen N,Chilov D,et al．Novel human vascular endothelial growth factor genes VEGF-B and VEGF-C localize to chromosomes 11q13 and 4q34 respectively[J]．Circulation,1996,93(6)：1079-1082．

[3]Jenne D E，Rammann H．Peutz-jeghers syndrome is caused by mutations in a novel serine threonine kinase[J]．Nature Genetics, 1998,18(1)：38-43．

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[6] 黃蓓,任艷敏,魏皓,等．LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法及在腫瘤發(fā)生中檢測的應用[J]．中國生物制品雜志,2009,21(11)：995-999．

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Expression of LKB1 and VEGF-C in nasopharyngeal carcinoma and their clinicopathological significance

Objective To investigate the expression of LKB1 and VEGF-C in nasopharyngeal carcinoma and their clinicopathological significance．MethodsTissue specimens were collected from 50 patients with nasopharyngeal carcinoma(NPC group)and 50 patients with chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa(control group)．The expression of LKB1 and VEGF-C mRNA in nasopharyngeal tissue was detected by RT-PCR and the correlation of LKB1 and VEGF-C expression with clinicopathological factors in NPC patients was analyzed．ResultsThe expression level of LKB1 mRNA was significantly lower and the expression of VEGF-C mRNA was significantly higher than those in control group(P＜0．05)．The expression of LKB1 and VEGF-C mRNA was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM stage(P＜0．05),not correlated with age and tumor size of the patients(P＞0．05)．LKB1 expression was negatively correlated with VEGF-C in NPC patients(r=-0．62,P＜0．05)．ConclusionLKB1 and VEGF-C are abnormally expressed in nasopharyngeal tissue of NPC patients,suggesting that they may be associated with the development and lymph node metastasis of nasopharyngeal carcinoma．

Nasopharyngealcarcinoma LKB1 VEGF-C

2013-12-13）

（本文編輯：歐陽卿）

蚌埠醫(yī)學院自然科學基金資助項目（Byky1244）

233000 蚌埠，蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

程忠強，E-mail：huoyan-9999@163.com