唐 雪，蔡傳斌，羅信旭，周景瑞，吳擁軍*

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

假定的賴氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，LDC，EC 4.1.1.18）存在于大多數(shù)微生物中，如大腸桿菌（Escherichia coli）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）、尸桿菌（Bacterium cadaveris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等。在微生物的合成途徑中，LDC可逆的將賴氨酸（lysine）通過脫羧反應(yīng)生成尸胺[1-2]。該酶是誘導(dǎo)性胞內(nèi)酶，需要磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）為輔酶促進(jìn)脫羧反應(yīng)[3]。

尸胺（1,5-戊二胺）是一種多胺，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生理活性的含氮堿[4]。它是微生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鐵離子濃度的“鐵親和系統(tǒng)”的主要組成成分，在關(guān)閉孔蛋白通道方面起著重要的作用，而且還是反芻獸新月單胞菌（Selenomonas ruminantium）、嗜堿性韋榮球菌（Veillonella alcalescens）、小韋榮球菌（V.parvula）和解脂厭氧弧菌（Anaerovibrio lipolytica）等一些嚴(yán)格厭氧的格蘭氏陰性菌的肽聚糖的組成成分之一。雖然尸胺是廣泛存在于生物體中的正常物質(zhì)，對人體沒有直接毒害作用，但它也作為一種肉毒胺存在于腐敗物中，也會(huì)加強(qiáng)酪胺和組胺對人體解毒作用的影響[5]。

貴州水豆豉發(fā)酵是通過微生物自然富集發(fā)酵傳統(tǒng)工藝，發(fā)酵期間主要參與的微生物為食品級(jí)安全菌株枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。但如果發(fā)酵環(huán)境控制不當(dāng)，蛋白腐敗也是食品中尸胺的主要來源。豆豉發(fā)酵對象大豆富含高蛋白，為控制豆豉發(fā)酵過程中過量尸胺的產(chǎn)生，以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的豆豉發(fā)酵生產(chǎn)菌株B.subtilisBJ3-2為目標(biāo)菌株[6]，根據(jù)GenBank中B.subtilis168標(biāo)準(zhǔn)菌株的yaaO基因序列設(shè)計(jì)同源引物，PCR擴(kuò)增B.subtilisBJ3-2基因組DNA，T克隆得到賴氨酸脫羧酶基因yaaO，測序后與NCBI登錄的其他枯草芽孢桿菌yaaO序列進(jìn)行同源性比對分析，分析LDC酶活性結(jié)構(gòu)域和酶活性位點(diǎn)。從而通過控制LDC的表達(dá)，降低豆豉發(fā)酵過程中生物胺的含量，對于保障食品安全具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）BJ3-2：本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存；E.coliDH5α：北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒、pGEM-T載體、溶菌酶（lysozyme）、rTaq酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、dNTPs：大連TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini KitⅠ：美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000TM Thermal Cycler PCR儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀、PowerPac HC電泳儀：美國Bio-Rad公司；Mini-6K微型離心機(jī)：杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的B.subtilis168菌株（登錄號(hào)為AL009126.3）的假定的賴氨酸脫羧酶基因yaaO序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列：上游引物P1：5'-ATGAACACACCTTTATATAAAG-3'；下游引物P2：5'-TCATGATTTCTCCTCTTCT-3'；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為1 443 bp，由大連TaKaRa公司合成。

1.3.2B.subtilisBJ3-2基因組提取

活化B.subtilisBJ3-2菌株，分離單個(gè)菌落，用接種環(huán)挑取接種至5 mL的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床140 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取B.subtilisBJ3-2基因組DNA。1%瓊脂糖電泳檢測基因組的完整性。

1.3.3 目的片段的擴(kuò)增

以B.subtilisBJ3-2基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq酶0.1 μL 補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃、5 min，94 ℃、40 s，45.5 ℃、40 s，72 ℃、90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4yaaO的克隆與測序

回收純化PCR產(chǎn)物，連接pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。經(jīng)菌落和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證后，將陽性重組質(zhì)粒送至大連TaKaRa公司測序。

1.3.5yaaO序列分析

對yaaO基因的核苷酸及氨基酸Blast進(jìn)行同源性分析。用BioXM2.6、DNAStar7.1、MEGA5、ClustalX1.81軟件對氨基酸保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析并繪制LDC遺傳進(jìn)化樹。用Swiss-Model及Deep View Version4.1繪制yaaO蛋白三維結(jié)構(gòu)及標(biāo)注活性位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增

提取基因組經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示，提取的DNA濃度較高，結(jié)構(gòu)完整，無顯著降解，可作為模板進(jìn)行下一步目標(biāo)基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果使用2%的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。如圖2所示，擴(kuò)增出一條符合1 443 bp大小預(yù)期片段。

圖1 枯草芽孢桿菌BJ3-2基因組Fig.1 Genome of Bacillus subtilis BJ3-2

圖2 PCR擴(kuò)增yaaO基因Fig.2 PCR amplification of yaaO

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與菌落PCR鑒定

對重組體進(jìn)行菌落PCR檢測，從圖3可以看出，約在1 443 bp處有特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)期基因組PCR擴(kuò)增yaaO基因的目的條帶大小相符，證明獲得了陽性的重組菌落。

2.3 陽性菌落的質(zhì)粒PCR鑒定

將獲得的陽性重組菌落接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，約在1 443 bp處出現(xiàn)特異性條帶，所獲得的基因片段大小均與前期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相吻合，說明目的基因已正確連接到pGEM-T載體內(nèi)，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將提取的質(zhì)粒送生物公司測序，并命名為pGEM-yaaO。

圖3 菌落PCR鑒定重組子Fig.3 PCR rapid identification of yaaO gene from recombinant clones

圖4 質(zhì)粒PCR鑒定Fig.4 PCR identification of plasmid

2.4 Bacillus subtilis BJ3-2賴氨酸脫羧酶的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹

使用DNAStar軟件對測序結(jié)果經(jīng)行分析后表明，B.subtilisBJ3-2賴氨酸脫羧酶基因yaaO的ORF大小為1443bp，共編碼480個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。BioXM2.6軟件推測目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為53.22 ku，G+C含量為43.59%，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）為6.23，其中酸性氨基酸19.8%，堿性氨基酸占13.5%。將基因序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of bio-technology information，NCBI）獲得基因登錄號(hào)KJ561349。

將所克隆的目的基因及推測表達(dá)的蛋白質(zhì)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析。結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2的yaaO基因與已報(bào)道枯草芽孢桿菌的yaaO基因序列和蛋白序列高度同源，都高達(dá)91%以上。與B.subtilis168菌株目的基因的基因序列高度同源達(dá)94%，yaaO氨基酸序列高度同源達(dá)96%。通過與其他枯草芽孢桿菌的（yaaO）的核苷酸序列比對，序列同源性最高的是Bacillussp.JS（yaaO），達(dá)到99%；與枯草桿菌其他種（yaaO）序列同源性也在91%以上。表明本實(shí)驗(yàn)所克隆的目的基因?yàn)橘嚢彼崦擊让富颉?/p>

B.subtilisBJ3-2賴氨酸脫羧酶氨基酸序列與芽孢桿菌JS（Bacillussp.JS）同源性最高，為99%。與其他枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）假定的賴氨酸脫羧酶氨基酸序列同源性都高達(dá)91%以上。其中，與B.subtilisE1精氨酸/賴氨酸氨基酸同源性高達(dá)96%；與巴氏芽孢桿菌八疊球菌（Sporosarcina pasteurii）的精氨酸/賴氨酸/鳥氨酸脫羧酶氨基酸序列同源性也高達(dá)96%；與B.subtilisMB73/2菌株轉(zhuǎn)氨酶第四家族蛋白（aminotransferase class-V family protein）同源性高達(dá)96%；與Bacillussp.BSC154同源性高達(dá)95%。

B.subtilisBJ3-2 LDC基因同B.subtilisBJ3-2的精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylation，ADC）一樣，同屬于PLP依賴型脫羧酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。作為大多數(shù)細(xì)菌磷酸吡哆醛（PLP）依賴型脫羧酶的代表——乳酸菌（Lactobacillussp.30a）鳥氨酸脫羧酶家族（ornithine decarboxylase family），具有Ⅲ型PLP型脫羧酶的活性位點(diǎn)、PLP結(jié)合位點(diǎn)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。如圖5所示，選擇Lactobacillussp.30a的鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）氨基酸序列和B.subtilisBJ3-2的ADC氨基酸序列，對照B.subtilisBJ3-2的LDC氨基酸序列進(jìn)行比對。如圖6所示，選擇高度同源的枯草芽孢桿菌其他菌株LDC序列以及李斯特單核細(xì)胞增生菌EGD-e菌株（Listeria monocytogenesEGD-e）的LDC作為厚壁菌門代表，結(jié)構(gòu)域不同的大腸桿菌（E.coliATCC 8739）LDC序列作為參比，增加LDC氨基酸序列所特有保守序列及酶活性位點(diǎn)推測的可靠性。

圖5 B.subtilis BJ3-2ADC/LDC和Lactobacillus sp.30a ODC的氨基酸多序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignments of B.subtilis BJ3-2 ADC/LDC and Lactobacillus sp.30a ODC

賴氨酸脫羧酶作為精氨酸/賴氨酸/鳥氨酸脫羧酶家族成員之一，該家族又屬于吡哆醛磷酸鹽（PLP）依賴型天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）超級(jí)大家族。從圖5和圖6對氨基酸脫羧酶結(jié)構(gòu)域分析顯示：B.subtilisBJ3-2 LDC與B.subtilisBJ3-2 ADC一樣，屬于丙氨酸消旋酶家族，在序列的N端含有賴氨酸（單字母縮寫為K）的保守序列[AS]-V-[IV]-K-A[DN]-A-Y-G-H-G，幾乎在所有丙氨酸消旋酶的氨基酸序列存在[7]。且具有PLP依賴型脫羧酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域，即PLP活性位點(diǎn)，包括[FDSAW]、[RNNHKSVYNSA]、[S-X-H-K]，屬于典型的Ⅲ型PLP依賴型鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族成員。[FDSAW]是所有氨酸轉(zhuǎn)氨酶/氨基酸脫羧酶共有的保守結(jié)構(gòu)域，與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊有關(guān)。[S-X-H-K]序列中Lys（K）是PLP依賴型脫羧酶的活性位點(diǎn)，PLP通過與Lys氨基酸殘基形成醛亞胺鍵（席夫堿），使酶具有催化活性[8-9]。[RNNHKSVYNSA]序列中的His氨基酸殘基改變分子極性作用，是所有脫羧酶及一些其他PLP依賴型酶共有結(jié)構(gòu)域，推測其與催化作用有重要關(guān)系[10]。

圖6 B.subtilis BJ3-2和其他細(xì)菌LDC/ODC的氨基酸多序列比對Fig.6 Amino acid sequence alignments of LDC/ODC of B.subtilis BJ3-2 and other bacteria

從圖6可以看出，B.subtilisBJ3-2 ADC、B.subtilisBJ 3-2 LDC與Lactobacillussp.30a ODC中還存在[PGHQGG]、[LGDL]、[GD]、[TYDG]、[SPFYPMYAALD]、[DPNK]、[YPPG]高度保守結(jié)構(gòu)域，與賴氨酸脫羧酶家族推測的保守結(jié)構(gòu)域[PGGXGTXXE]得到印證[11]。與圖7相比，[GD]、[TYDG]結(jié)構(gòu)域沒有顯示出高度保守的結(jié)構(gòu)特征，推測[GD]、[TYDG]結(jié)構(gòu)域可能是鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族（Orn/Lys/Arg decarboxylase family）所特有的保守結(jié)構(gòu)域，而[GSS]是兩圖對比所共有的結(jié)構(gòu)域，劉艷敏[12]對枯草芽孢桿菌BJ3-2 與其他枯草芽孢桿菌ADC序列同Lactobacillussp.30a ODC 比對發(fā)現(xiàn)[PGEK]是B.subtilisBJ3-2 ADC特有的結(jié)構(gòu)域，而[GVPATI]是B.subtilisBJ3-2 LDC與Lactobacillussp.30a ODC特有的結(jié)構(gòu)域，推測該結(jié)構(gòu)域?yàn)檩o助因子，對鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶的不同代謝的調(diào)控具有重要意義。

圖7 不同細(xì)菌的精氨酸/鳥氨酸脫羧酶氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree constructed with amino acid sequences of different bacteria LDC/ODC

從圖7遺傳圖譜可以看出，枯草芽孢桿菌LDC均屬于遺傳距離較近的同一進(jìn)化分支。B.subtilisBJ3-2的與Bacillussp.JS的LDC的遺傳距離最近；與厚壁菌門金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）EGD-e的LDC遺傳距離次之；與E.coliATCC 8739 LDC以及Lactobacillussp.30a ODC遺傳距離最遠(yuǎn)。以上結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2與乳酸菌及其他厚壁菌門細(xì)菌的遺傳距離接近，具有PLP依賴型脫羧酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的Ⅲ型PLP依賴型鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族（Orn/Lys/Arg decarboxylase family）成員。

2.5 Bacillus subtilis BJ3-2 LDC蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISS-MODEL在線分析[13]，輸入Bacillus subtilisBJ3-2 LDC氨基酸序列進(jìn)行在線蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫里的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus）的鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族蛋白質(zhì)SAR0482同源性（identity）最高，為39.22%。Deep View Version1.3對該序列進(jìn)行編輯，預(yù)測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，如圖8所示，Ser-X-His-Lys是經(jīng)典的脫羧酶的指紋圖譜序列[14]。

圖8 B.subtilis BJ3-2 LDC蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)Fig.8 B.subtilis BJ3-2 LDC three dimensional protein structure

3 結(jié)論

經(jīng)多序列氨基酸比對，B.subtilisBJ3-2的LDC包含PLP依賴型脫羧酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)氨酶的輔因子為磷酸吡哆素，通過磷酸吡哆醛（PLP）與磷酸吡哆胺（phosphopyridoxamine，PMP）的轉(zhuǎn)化，形成希夫堿中間產(chǎn)物，使一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮酸，另一個(gè)α-酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌陌被醄15]。通過對賴氨酸脫羧酶氨基酸的序列分析，推測其鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶家族保守結(jié)構(gòu)域和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及酶催化活性位點(diǎn)。從其代謝途徑出發(fā)，通過分析LDC酶活性結(jié)構(gòu)，為控制豆豉發(fā)酵過程中生物胺-尸胺含量，提供一定的理論基礎(chǔ)。

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