高 潔

（國貿食品科學研究所，北京 100070）

氯霉素（choloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗菌藥物[1-2]，曾經廣泛應用于人體和各種動物疾病的治療和預防[3-4]，但是近期人們逐漸發(fā)現氯霉素在動物體內殘留量很大，人一旦長期食用含有氯霉素殘留的動物產品就會對人體健康造成極大的威脅，嚴重者引起再生障礙貧血和灰嬰綜合癥[5]，甚至危及生命。因此國家農業(yè)部把其列為禁止用于食品動物的抗生素[6]。甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）是一種氯霉素類藥物，目前也用于人和動物，存在濫用的風險，因此有必要對其進行監(jiān)控。

氯霉素及其同類物質的檢測方法有很多，如酶聯(lián)免疫法[7-8]、氣相色譜法[9]、膠體金免疫層析法[10]、液相色譜法[11-12]、電化學法[13]，但是實驗室中較為常用的還是液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-15]和氣相色譜-質譜聯(lián)用法[16]。本試驗采用負化學電離源氣相色譜-串聯(lián)質譜法檢測肉制品中的氯霉素與甲砜霉素，與單極質譜相比，降低了基線，增大了檢測信號的信噪比，提高了靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）、甲苯、正己烷（農殘級），乙酸乙酯、乙醚、氯化鈉（分析純）、氯霉素甲砜霉素標準品、間氯霉素標準品：比利時Acros公司。

衍生化試劑：N，O雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（BSTFA+TMCS，99+1）：美國REGIS公司。

固相萃取柱：弗羅里硅土柱（6.0 mL，1 g）：北京振翔貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

Varian450GC/320MS配有化學電離（chemical ionization，CI）源：美國瓦里安有限公司；HR2095組織搗碎機：荷蘭皇家飛利浦公司；固相萃取裝置：北京振翔科技有限公司；R-3型旋轉蒸發(fā)儀：瑞士步琪有限公司；KQ-500DB型數控超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；LC-212恒溫箱：廣東宏展科技有限公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：蘇州奇樂電子科技有限公司；CS-H1渦旋混合器：南京東邁科技儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器公司。

1.3 實驗方法[21]

1.3.1 樣品處理方法

稱取5 g粉碎的肉制品于50 mL具塞離心管中，加入0.5 μg/mL內標10 μL和30 mL乙酸乙酯離心取上清液，再提取一次合并提取液，35 ℃旋轉蒸發(fā)至1～2 mL，待凈化。正己烷液-液萃取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次提取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 ℃旋轉蒸發(fā)至近干，氮氣吹干。弗羅里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚（3+7）和5 mL乙醚淋洗備用。將前述殘渣用5 mL乙醚溶解上樣，用5 mL乙醚淋洗，5 mL甲醇-乙醚（3+7）洗脫，洗脫液用氮氣吹干。凈化后的試樣用0.2 mL甲苯溶解，加入0.1 mL衍生化試劑混合，于70 ℃衍生60 min。氮氣吹干，用1.0 mL正己烷定容，待測定。

1.3.2 色譜條件[17]

VF-5MS色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm；50 ℃保持1 min，以25 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持5 min；自動進樣器，無分流進樣1 μL，載氣：氦氣；離子源：200 ℃，負離子化學源（negative chemical ionization，NCI）模式，反應氣為甲烷，壓力800 Pa，電子能量70 eV，掃描方式為多離子監(jiān)測模式。氯霉素選擇母離子為m/e466，監(jiān)控子離子為m/e304和m/e322；甲砜霉素選擇母離子為m/e499，監(jiān)控子離子為m/e355與265。碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID）氣壓：氬氣0.239 Pa。

1.4 計算公式

樣品中氯霉素與甲砜霉素的含量（X）按下式計算：

注：X為樣品中氯霉素與甲砜霉素含量，μg/kg；C為試樣中氯霉素與甲砜霉質量濃度，μg/L；V為試樣最終定容體積，mL；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 二級質譜條件優(yōu)化

2.1.1 母離子選擇

在一級質譜條件下氯霉素的主要離子有m/e466、468、376、378，甲砜霉素的主要離子有m/e409、411、499、501。其中氯霉素的m/e466離子響應最大，甲砜霉素m/e499離子響應最大，因此選擇這兩個離子分別作為兩種物質的母離子。

2.1.2 子離子選擇

分別以m/e466和m/e499離子為母離子，固定CID氣壓0.239 Pa，在不同電壓條件下掃描質荷比100～500范圍內兩種母離子的子離子碎片，結果分別如圖1與圖2所示。

從圖1、圖2可以看出，氯霉素響應最大的兩個子離子為m/e322與m/e304，甲砜霉素響應最大的兩個離子為m/e355與m/e265。

圖1 氯霉素子離子選擇Fig.1 Selection of ions for chloramphenicol

圖2 甲砜霉素子離子選擇Fig.2 Selection of ions for thiamphenicol

2.1.3 碰撞電壓優(yōu)化

固定氯霉素與甲砜霉素的母離子與子離子，改變碰撞電壓，記錄離子響應強度，結果如圖3所示。從圖3可以看出，466-304離子對最佳碰撞電壓為6 V，466-322離子對最佳碰撞電壓為5 V，499-355離子對最佳碰撞電壓為6 V，499-265離子對最佳碰撞電壓為7 V。

2.2 靈敏度比較

取不含目標化合物的陰性樣品加標氯霉素與甲砜霉素各10 ng后進行檢測，一級質譜與二級質譜定量離子的信噪比如表1所示，譜圖比較如圖4所示。由表1、圖4可以看出，采用二級質譜后信噪比明顯提高從而提高了檢測靈敏度。

圖4 一級質譜與二級質譜靈敏度比較Fig.4 Sensitivity of MS and MS/MS

2.3 標準曲線與檢出限

將處理好的梯度濃度標液依次進樣，以標樣峰面積與內標峰面積之比對標樣與內標濃度之比作圖，得到工作曲線，氯霉素：y=0.975 9x-0.063 3，r2=0.992 5；甲砜霉素：y=3.581 5x+0.072 9，r2=0.997 3，檢出限為：氯霉素0.02 μg/kg，甲砜霉素0.1 μg/kg。

2.4 加標回收率和精密度實驗

表2 加標回收率和精密度實驗結果Table 2 Results of adding standard recovery and degree of precision

取不含目標化合物的陰性樣品進行不同加標水平加標回收實驗，每個加標水平平行進行8次實驗，結果如表2所示。由表2可知，氯霉素及甲砜霉素的加標回收率在86%～97%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.8%～12.3%。

3 結論

采用氣相色譜串聯(lián)質譜法，采用負化學電離源，對氯霉素與甲砜霉素分別選擇合適的母離子、子離子及碰撞電壓，有效減少了基質干擾，提高了檢測的準確性與靈敏度。實際樣品不同濃度水平的加標實驗結果顯示該方法具有良好的線性、準確度與精密度，可實現對肉制品中痕量氯霉素與甲砜霉素的準確快速檢測。

[1]張秋勝，徐丙蓮，劉林德，等.10 種真菌深層發(fā)酵液抑菌活性分析[J].中國釀造，2010，29（9）：70-72.

[2]尹群健，陳瀟驍，楊宏勝，等.產瓊膠酶菌株Agarivoranssp.FG15 的篩選鑒定與酶學性質[J].中國釀造，2014，33（2）：17-22.

[3]董曉娟，朱春桃.氯霉素治療恙蟲病肺炎的臨床療效觀察[J].實用心腦肺血管病雜志，2013，21（11）：75-76.

[4]張 媛.氯霉素鋅油結合氧療治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期褥瘡的效果觀察[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2013，27（11）：31-32.

[5]邢海燕，胡春萍，蔡雪婷，等.再生障礙性貧血小鼠造模方法[J].中國老年學雜志，2013，33（23）：5888-5890.

[6]李秀萍，尉新華，孫艷霞.淺談氯霉素的危害及控制[J].中國動物檢疫，2003，20（5）：18.

[7]李 璟，陳世界，李 凜，等.ELISA 檢測蜂王漿氯霉素殘留的快速前處理方法[J].西北農業(yè)學報，2012，21（6）：182-185.

[8]陳俊玉，何建順，李長順，等.酶聯(lián)免疫法快速篩檢洗潔精中的氯霉素[J].福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（5）：1-2.

[9]馬麗莎，鄭光明，陳昆慈，等.氣相色譜法測定水產品中氯霉素的不確定度分析[J].中國漁業(yè)質量與標準，2013，3（4）：15-20.

[10]李余動，張少恩，吳志剛，等.膠體金免疫層析法快速檢測氯霉素殘留[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2005，17（5）：416-419.

[11]劉 敏.高效液相色譜法測定氯麻滴鼻液的有關物質[J].中國藥業(yè)，2013，22（13）：28-29.

[12]陳玉爽，張勝波.HPLC 法測定氯霉素地塞米松乳膏中氯霉素的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2013，26（3）：376-377.

[13]郝婷婷，謝文婷，李琴芬，等.分子印跡固相萃取-電化學發(fā)光檢測牛奶中氯霉素[J].分析試驗室，2012，31（2）：105-108.

[14]劉彩云，唐守嶸，邵建寧，等.蜂蜜中氯霉素的UPLC/MS-MS 檢測方法研究[J].中國釀造，2008（24）：101-103.

[15]馮 民，魏云計，朱臻怡，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定飼料中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素殘留量[J].分析測試學報，2013，32（1）：117-121.

[16]李 鵬，邱月明，蔡慧霞，等.氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定動物組織中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的殘留量[J].色譜，2006，24（1）：14-18.

[17]GB/T 22338—2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定[S].北京：全國信息與文獻標準化技術委員會，2008.