黃 勛，王常蘇，高澤鑫，高 冰*

（1.武漢生物工程學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，湖北 武漢 430415；2.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；3.湖北工業(yè)大學(xué) 輕工學(xué)部，湖北 武漢 430068）

紅曲霉作為發(fā)酵食品使用菌在我國已有上千年的使用歷史，應(yīng)用于食品著色和藥用。自20世紀(jì)70年代末，日本ENDO A[1]發(fā)現(xiàn)紅曲霉代謝產(chǎn)物中Monacolin K具有降膽固醇的功能，促進(jìn)了紅曲霉的研究與應(yīng)用。紅曲的次級代謝產(chǎn)物主要有紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、桔霉素（citrinin）等，前三者已證明其具有重要的生理活性功能。紅曲色素作為食品著色劑廣泛應(yīng)用于肉制品、釀酒制醋等[2]。Monacolin K作為膽固醇合成抑制劑，能減少體內(nèi)膽固醇的合成，調(diào)節(jié)人體內(nèi)異常血脂以及治療，是一種理想的降膽固醇和血脂藥物[3-6]，此外Monacolin K還具有預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、預(yù)防老年癡呆和降低中風(fēng)風(fēng)險以及對腎臟免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]。陳運(yùn)中等[9]通過動物試驗(yàn)證明了Monacolin K具有抗疲勞作用。GABA具有降血壓和預(yù)防老年癡呆的生理作用[10]。

發(fā)芽黃豆因富含豐富的γ-氨基丁酸，并且大豆在發(fā)芽過程中脂肪、總糖含量降低，滿足了人們對于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[11-13]，尤其是大豆發(fā)芽過程中一些功能性因子的生物合成和積累引起了人們關(guān)注，如大豆經(jīng)適當(dāng)?shù)陌l(fā)芽，提高了大豆中異黃酮的含量[14]以及GABA的積累量。大豆異黃酮具有抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防心血管疾病以及抗癌等豐富的功能。GABA是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動物和植物體內(nèi)，并具有多種人體的生理調(diào)節(jié)功能，是哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì)。此外，具有多功能的生理保健作用，對于其應(yīng)用到產(chǎn)品的研發(fā)中是十分有價值的[15]。該文以發(fā)芽黃豆為主要原料，通過固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化產(chǎn)Monacolin K的工藝參數(shù)，以提高產(chǎn)品中Monacolin K的含量，同時提高了營養(yǎng)和保健功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅色紅曲菌（Monascus rubbervan Tieghem）、高產(chǎn)Monacolin K菌株M1、紅曲霉（Monascus rubber）GIM3.439、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sce01：武漢輕工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

紅曲斜面培養(yǎng)基：12°Bx 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，pH自然。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)芽黃豆100 g，葡萄糖5 g，蛋白胨3 g，NaNO30.45 g，ZnSO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g。

酵母液體培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

發(fā)芽大豆培養(yǎng)基：發(fā)芽黃豆50 g，裝入250 mL的三角瓶中，115 ℃，滅菌30 min。

麥芽汁斜面培養(yǎng)基：將麥芽粉碎后，按1∶4的比例加蒸餾水混合，63 ℃水浴加熱4～5 h糖化水解，加碘液檢測是否水解完全，4～6層紗布過濾，取濾液測糖度，加蒸餾水調(diào)至糖度為5～6，pH自然，加2.5%瓊脂條后高壓滅菌。

1.1.3 試劑

黃曲霉毒素B1、桔霉素（色譜純）：澳大利亞Fermentek Ltd公司；甲酸（色譜級）、硼酸鈉、乙腈、乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀，均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；洛伐他丁（色譜純）：中國藥品生物制品檢驗(yàn)所；苯酚（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉溶液（分析純）：天津市津北精細(xì)化工有限公司；冰醋酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜級）：江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；磷酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲苯（色譜級）：江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80高速萬能粉碎機(jī)：鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；40/100目分樣篩：中國安平振興篩具廠；WelchromTM 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大連依利特分析儀器有限公司；KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；1100型高效液相色譜色譜儀：美國安捷倫公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細(xì)胞破壁液制備工藝

用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上接種已經(jīng)培養(yǎng)18 h的酵母菌3環(huán)至50 mL PDA培養(yǎng)基中，在30 ℃和120 r/min培養(yǎng)18 h，然后將培養(yǎng)的釀酒酵母液經(jīng)120 r/min離心、無菌水洗滌后，置于內(nèi)有石英砂已滅菌研缽中研磨15 min，然后于12 000 r/min 離心1 min，所得上清液為酵母破壁液。

1.3.2 發(fā)芽大豆固態(tài)發(fā)酵功能紅曲產(chǎn)Monacolin K工藝

（1）發(fā)酵的工藝流程圖

（2）發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟

將保藏的紅曲菌經(jīng)平板活化后，接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)6 d，分別用3 mL 0.2%無菌冰醋酸溶液洗脫斜面孢子，接種一定量的M1和GIM3.439的混合孢子液（1∶1，V/V）于發(fā)芽黃豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃培養(yǎng)6 d（其中在發(fā)酵的不同階段分別接入釀酒酵母破壁液），再轉(zhuǎn)入其他溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 d。待有微量菌絲長出后每隔12 h搖瓶，累積發(fā)酵完成后烘干，用高效液相色譜法檢測Monacolin K含量。

1.3.3 發(fā)芽大豆固態(tài)發(fā)酵功能紅曲產(chǎn)Monacolin K試驗(yàn)

（1）不同初始含水量對產(chǎn)Monacolin K的影響

采用固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在基質(zhì)發(fā)芽黃豆滅菌冷卻后稱質(zhì)量，調(diào)節(jié)初始含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%，接種紅曲菌M1發(fā)酵，發(fā)酵完成后檢測Monacolin K含量。

（2）分段式溫度培養(yǎng)對產(chǎn)Monacolin K的影響

采用固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在其他發(fā)酵條件不改變的情況下，改變培養(yǎng)溫度，先把菌株置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)6 d后，分別轉(zhuǎn)入22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵完成后檢測Monacolin K含量。

（3）正交試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母破壁液對產(chǎn)Monacolin K的影響

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)陳璐等[16]的研究，通過對釀酒酵母破壁液的接種量、菌齡、接種時間設(shè)計L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的發(fā)酵條件，因素水平見表1。

表1 添加酵母破壁液發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

1.3.4 功能成分分析

（1）Monacolin K含量測定

取發(fā)酵過篩處理后的樣品0.5 g于離心管中，用3 mL甲醇溶液溶解，再800 W超聲30 min，于40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫過夜。離心，取上清液進(jìn)行HPLC檢測。

HPLC檢測條件：檢測波長238 nm；流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃；流動相為甲醇/0.1%磷酸水=73∶27。

Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取一定量的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇溶液，加入一定量物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，超聲30 min后40 ℃水浴過夜，加磷酸溶液中和，甲醇定容至50 mL容量瓶得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液過0.45 μm濾膜待用。

（2）γ-氨基丁酸的測定

γ-氨基丁酸的檢測采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

（3）桔霉素檢測

樣品處理：將在40 ℃干燥處理的豆豉粉研磨粉碎，過100目篩，取適量的豆豉粉溶于20 mL復(fù)合萃取劑（甲苯∶乙酸乙酯∶酸=7∶3∶1），超聲20 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液，沉淀物重復(fù)萃取兩次，收集上清液，40 ℃真空濃縮至干，用30 mL甲醇溶解，過0.45 μm濾膜待用。

色譜條件：Welch公司反向色譜柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫28 ℃；紫外檢測波長254 nm；流動相為甲醇/水=55∶45，磷酸調(diào)pH 為4.0，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用甲醛溶液稀釋成100 μg/mL，再分別配制質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長254 nm處測定其吸光度值。

（4）黃曲霉毒素B1的測定

樣品處理：取適量過篩后的紅曲粉溶于8 mL復(fù)合萃取劑（乙腈∶水=21∶4），800 W超聲提取20 min，3 000 r/min，20 min離心，取上清液，沉淀物重復(fù)萃取2次，收集上清液，40 ℃真空濃縮至干，用1 mL的流動相溶解，過0.45 μm濾膜待用。

色譜條件：反向色譜柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫28 ℃；紫外檢測波長365 nm；流動相為水∶甲醇∶乙腈=5∶4∶1，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用流動相定容至1 L，再配制質(zhì)量濃度分別為0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長365 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)配制后得到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以峰面積積分值y為縱坐標(biāo)，Monacolin K質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，得到Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=43.023x。試驗(yàn)表明Monacolin K在5～50 μg/mL范圍具有良好的線性關(guān)系。

2.2 基質(zhì)初始含水量的確定

初始含水量對Monaconlin K含量的影響見圖1。由圖1可知，隨著基質(zhì)含水量的增加，Monaconlin K含量的變化趨勢呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在初始含水量為40%時，紅曲發(fā)酵代謝產(chǎn)Monacolin K含量最高。適量的水分有利于紅曲的生長，水分過低，物料干燥，菌絲生長較慢，水分過高，發(fā)酵后期游離水過多導(dǎo)致物料的黏液過多，均不利于功能性代謝產(chǎn)物的累積。因此選擇最佳基質(zhì)初始含水量為40%。

圖1 初始水含量對Monaconlin K產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of initial water content on Monaconlin K production

2.3 分段培養(yǎng)溫度的確定

發(fā)酵溫度對Monacolin K含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，Monaconlin K含量的變化趨勢呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。試驗(yàn)表明在接種紅曲菌30 ℃恒溫發(fā)酵的第6天，M1、GIM3.439菌株分別轉(zhuǎn)入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，累積發(fā)酵后檢測Monacolin K含量達(dá)到最高值。因此選擇發(fā)酵溫度為26 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on Monaconlin K production

2.4 釀酒酵母破壁液對Monacolin K的影響正交試驗(yàn)結(jié)果

對釀酒酵母破壁液的接種量、菌齡、接入時間、溫度設(shè)計L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的發(fā)酵條件，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 添加酵母菌破壁液正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment result

由表2可知，4種因素對Monacolin K含量的影響次序?yàn)椋禾砑恿浚ˋ）＞菌齡（B）＞接入時間（C）＞溫度（D）。分析正交試驗(yàn)結(jié)果得到的最優(yōu)水平A3B3C2D3，即酵母菌培養(yǎng)40 h按3.0%的接種量接種到已接種紅曲菌發(fā)酵3 d的基質(zhì)中，在26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，Monacolin K產(chǎn)量為2.22 mg/g。由表3可知，接種量對試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），其他因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響均不顯著。

2.5 產(chǎn)品的功能性及安全性評價

2.5.1γ-氨基丁酸的檢測分析

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》，采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行分析，γ-氨基丁酸的含量達(dá)到16.18 mg/g。

2.5.2 桔霉素檢測分析

以峰面積為縱坐標(biāo)，桔霉素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)表明在5～50 μg/L范圍具有良好的線性關(guān)系。通過檢測發(fā)酵產(chǎn)品中桔霉素含量為0.10 mg/kg，按日本相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在限量范圍內(nèi)。

2.5.3 黃曲霉毒素B1檢測分析

以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)表明，在0.5～5.0 μg/L范圍具有良好的線性關(guān)系。通過檢測發(fā)酵產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1含量為3.4 μg/kg，在國標(biāo)限量范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

以Monacolin K為指標(biāo)，通過單因素和正交優(yōu)化發(fā)酵工藝，得到最佳的發(fā)酵條件：采用經(jīng)乳酸浸泡后，基質(zhì)含水量為40%的發(fā)芽大豆，經(jīng)滅菌冷卻后，接種紅曲M1和GIM3.439共同發(fā)酵，發(fā)酵3 d后，按3.0%的接種量接種已培養(yǎng)40 h的酵母種子液，在26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，發(fā)酵產(chǎn)品中Monacolin K含量達(dá)到2.22 mg/g。原料經(jīng)紅曲霉、釀酒酵母和功能紅曲發(fā)酵后，產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味非常好，干燥處理后香氣濃郁。營養(yǎng)價值高，特別是γ-氨基丁酸的積累達(dá)到16.18 mg/g。通過檢測發(fā)酵產(chǎn)品中桔霉素含量為0.10mg/kg，黃曲霉毒素B1含量為3.4 μg/kg，均在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限量范圍內(nèi)。

[1]ENDO A.Monacolin K,A new hypocholesterolemic agent produced by aMonascusspecies[J].J Antiriot,1979,2(8):852-854.

[2]張志剛，馬歌麗.紅曲霉菌的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].食品加工，2007，32（8）：6-7.

[3]付海平，林親錄，何煜波.紅曲霉中Monacolin K 的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2003（6）：50-54.

[4]田隨安，張向兵.高效液相色譜法測定紅曲米中莫拉可林K 的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（9）：1996-1997.

[5]張慶慶，危勤濤，湯 斌，等.紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K 的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2008，25（1）：51-54.

[6]王慧穎，王淑華.降脂紅曲的研究與應(yīng)用[J].生物技術(shù)，1992（2）：5-9.

[7]張惠芳，黃之訓(xùn).功能紅曲生理活性作用機(jī)制和治療保健功效[J].中華醫(yī)學(xué)與健康，2007，3（2）：77-79.

[8]丘振宇，王亞琴，許喜林.紅曲霉中Monacolin K 的應(yīng)用研究[J].中國釀造，2007，26（5）：4-6.

[9]陳運(yùn)中，張聲華，陳春燕.紅曲米提取物的抗疲勞作用動物實(shí)驗(yàn)[J].營養(yǎng)學(xué)報，2005，27（5）：433-434.

[10]張 暉，姚惠源，姜元榮.富含γ-氨基丁酸保健食品的研究與開發(fā)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（9）：69-72.

[11]LEE C K,KARUNANITHY R.Effects and germination on the chemical composition of glycine and phase bean[J].J Sci Food Agr,1990(51):437-445.

[12]BAU H M,VILLAUME C,NICOLAS J P,et al.Effect of germination on chemical composition,biochemical consititnents and antinutritional factor of soya bean(glycinemax)seed[J].J Sci Food Agr,1997,73(1):1-9.

[13]苗 穎，馬 鶯.大豆發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分變化[J].糧食與油脂，2005（5）：29-30.

[14]申進(jìn)海，王海峰，袁 健，等.大豆發(fā)芽期異黃酮含量變化的研究及其促進(jìn)劑的影響[J].中國糧油學(xué)報，2006，21（6）：75-77.

[15]肖鳳歧.積極開發(fā)GABA 食品[J].中國釀造，2004，23（12）：22-24.

[16]陳 璐，祁勇剛，王常蘇，等.多菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K 與GABA 的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：55-60.