凌曉曦， 劉 勇，， 張松柏， 匡 煒， 彭 靜， 周灝明， 張德詠，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙410128；2.湖南省植物保護研究所，長沙 410125）

南方水稻黑條矮縮病毒湖南分離物S9片段ORF序列分析

凌曉曦1， 劉 勇1，2， 張松柏2， 匡 煒2， 彭 靜2， 周灝明2， 張德詠1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙410128；2.湖南省植物保護研究所，長沙 410125）

摘要本文克隆了湖南省2011－2013年水稻的15個SRBSDV分離物S9兩個基因，并測定了其核苷酸序列，序列分析與比較表明，S9兩個ORF序列同源性均大于99.5%。突變位點分析表明，S9編碼的兩個ORF有3～9個突變位點，但大部分的核酸突變?yōu)闊o義突變。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，S9編碼的兩個ORF高度同源，處于相同的的系統(tǒng)發(fā)育分支。

關(guān)鍵詞南方水稻黑條矮縮?。?ORF； S9片段； 序列分析

南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice blackstreaked d warf virus，SRBSDV）于2001年在廣東省陽西縣首次發(fā)現(xiàn)［1］，2008年被正式鑒定為呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus）第2組的一個新種［2-3］。2009年，該病在廣東、海南、江西和湖南等省的部分稻區(qū)暴發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計，造成約6 500 hm2水稻失收，受害面積達30萬hm2［4］。

SRBSDV的基因組由10條雙鏈RNA（dsRNA）組成，根據(jù)電泳遷移速率從慢到快依次命名為S1～S10。由于SRBSDV是2008年后才被人們熟知和廣泛關(guān)注的新病毒，因此對其編碼蛋白的功能研究甚少。根據(jù)SRBSDV與RBSDV同屬于斐濟病毒屬且編碼蛋白的高度同源性，可以推測SRBSDV編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白（P1、P2、P3、P4、P8、P10）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（P5-1、P5-2、P6、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2）；推測結(jié)構(gòu)蛋白P1為病毒RNA依賴的RNA聚合酶，P2為病毒內(nèi)核的組分，P3為帽子酶，P4為病毒外殼的B刺突蛋白，P8為病毒的核心衣殼蛋白，P10為病毒主要外層衣殼蛋白，其序列具有保守性，是分類和鑒定病毒屬種的重要依據(jù)［5-9］。目前已有的研究主要針對SRBSDV編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的功能。最新研究推測表明P5-1、P6蛋白與病毒原質(zhì)的形成有關(guān)，P7-1蛋白可能參與病毒的擴散［10］。

病毒、寄主以及傳毒介體長期的互作過程中，均會發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變，大量研究表明，病毒、寄主和傳播介體，在相互作用過程中存在協(xié)同進化［11］。SRBSDV的S9編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白是提供病毒復(fù)制和裝配場所病毒原質(zhì)（viroplasm）的組分之一［9］，在SRBSDV的增殖過程中發(fā)揮重要功能。這些基因的進化，將影響SRBSDV的復(fù)制，從而影響該病毒的侵染性及寄主適應(yīng)性，在SRBSDV遺傳多樣性的研究中，已有S10的報道［12-13］。但目前鮮見SRBSDV的S9編碼基因的遺傳多樣性研究報道。

本文克隆了2011－2013年湖南省不同地區(qū)侵染水稻的SRBSDV的基因組組分9（S9）的兩個ORF，分析了其突變和遺傳多樣性，為該病害的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻樣品

從湖南省主要水稻產(chǎn)區(qū)采集樣品，－20℃保存。

1.2 總RNA的提取及RT-PCR

水稻總RNA抽提采用TRIzol法，SRBSDV的RT-PCR檢測方法見參考文獻［2］，檢測引物為S10-F：5′-CGCGTCATCTCAAAACTACAG-3′，S10-R：5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′，擴增片段大小約為700 bp。

1.3 S9的ORF序列克隆與分析

根據(jù)GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／）中SRBSDV S9全序列（EU523359），設(shè)計2對引物（表1），擴增目標(biāo)片段包含SRBSDV S9的兩個ORF及間隔區(qū)（圖1）大小分別為1 078 bp和1 272 bp。

圖1 序列克隆引物Fig.1 Primers for cloning the sequences

表1 S9 ORFs克隆引物Table 1 The primers of cloning S9 ORFs of SRBSDV

序列測定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，利用生物信息學(xué)軟件Mega 4［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV檢測及S9部分序列克隆

湖南省采集的50個水稻樣品中，RT-PCR檢測結(jié)果表明，共有15個陽性樣品（表2）。以SRBSDV陽性水稻樣品總RNA為模板，以設(shè)計的2對特異性引物，進行RT-PCR擴增，擴增片段采用瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果表明，設(shè)計的兩對引物均能擴增出與預(yù)期大小一致的單一目的條帶。切膠回收擴增產(chǎn)物，鏈接到T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，序列測定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。測定的序列登錄NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／），登錄號見表2。

表2 SRBSDV陽性樣品信息表Table 2 Sequenced rice samples infected by SRBSDV

續(xù)表2 Table2（Continued）

2.2 S9ORF序列分析

2.2.1 突變位點分析

序列聯(lián)配結(jié)果表明，SRBSDV的15個湖南分離物的S9兩個ORF核酸序列都具有數(shù)目不一的突變位點，其中以SRBSDV-HuNyz6的突變位點最多，有9個位點發(fā)生突變。推測蛋白聯(lián)配結(jié)果表明，僅有少量核酸突變位點，導(dǎo)致氨基酸突變。

S9ORF1的核酸序列的轉(zhuǎn)換／顛換率比率為k1＝10.987（嘌呤）和k2＝19.599（嘧啶）。整體轉(zhuǎn)換／顛換偏差為R＝5.454，序列變異偏好A／G或C／T的轉(zhuǎn)換（表3）。S9ORF2的核酸序列的轉(zhuǎn)換／顛換率比率為k1＝9.402（嘌呤）和k2＝17.041（嘧啶）。整體轉(zhuǎn)換／顛換偏差為R＝4.564，序列變異偏好A／G或C／T的轉(zhuǎn)換（表4）。

表3 S9ORF1堿基替換最大可能性分析Table3 Maximumcompositelikelihoodestimate ofthepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF1

表4 S9ORF2堿基替換最大可能性分析Table4 Maximumcompositelikelihoodestimateof thepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF2

2.2.2 核酸遺傳距離分析

利用Mega4軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2，圖3），采用Kimura 2-參數(shù)模型（核酸序列）計算遺傳距離，繪制序列系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，S9ORF1的同源性為99.54%，遺傳距離平均值為0.0096±0.0038，S9ORF2的同源性為99.68%，遺傳距離平均值為0.0038±0.0019。

系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，湖南省的15個SRBSDV分離物S9的兩個ORF高度同源，處于一個進化分支（圖2，圖3）。

圖2 SRBSDVS9ORF1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 PhylogenetictreeofSRBSDVS9ORF1

圖3 SRBSDV S9 ORF2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SRBSDV S9 ORF2

3 討論

南方水稻黑條矮縮?。⊿RBSDV）是近年來在水稻上發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，目前，該病毒的基因組序列、編碼蛋白功能、與寄主互作等都有研究報道［9，15］，特別是采用高通量測序技術(shù)及生物學(xué)研究表明，SRBSDV對傳毒介體［16］具有多方面的影響。這些研究工作為研究SRBSDV遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)和參考。

湖南省2011－2013年水稻的SRBSDV分離物的S9兩個ORF的序列比較表明，其同源性很高（＞99.5%），大部分的核酸突變?yōu)闊o義突變，表明S9的兩個ORF遺傳穩(wěn)定性高。這可能是與其編碼基因的重要功能［11］相關(guān)，這兩個基因的突變，將導(dǎo)致病毒無法復(fù)制和裝配。此外，研究表明，由昆蟲介體傳播的植物病毒，受介體和寄主的雙重選擇壓力，其進化受到相對較大的限制［17］。湖南省水稻的15個SRBSDV高度同源，也符合昆蟲介體傳播病毒同源性高的特征。

來自于湖南省不同年份不同地區(qū)的15個SRBSDV-S9高度同源，與已有文獻報道的來自于我國南方不同稻區(qū)、不同年份水稻的SRBSDVS10［7，12］和SRBSDV-S7-9［2-3，7，12］同源性高的結(jié)果一致，這可能與SRBSDV的源頭有關(guān)。由于SRBSDV僅由白背飛虱傳播［3］，白背飛虱是遷飛性害蟲［18］，因此，每年我國南方的SRBSDV最初源頭都來源于白背飛虱的越冬區(qū)，因不存在地理隔離等導(dǎo)致的進化壓力，故SRBSDV的來源單一，遺傳多樣性較小。

本研究結(jié)果表明，湖南省不同稻區(qū)與我國南方其他地區(qū)稻區(qū)的SRBSDV來源相同，這對生產(chǎn)上防治此病害具有重要的指導(dǎo)意義。由于毒源來源單一且為外來遷入，對于湖南SRBSDV的防控，最好的辦法是在SRBSDV的毒源地進行源頭防控，這需要全國范圍內(nèi)甚至國際間的合作。此外，針對其毒源來源單一的特點，可主抓病源侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其是在其大量擴散時，于白背飛虱遷入高峰期全力、高效、快速防控遷入的白背飛虱成蟲以切斷介體的初始傳毒和毒源的初始侵染，對于已遷入湖南省等地區(qū)的毒源，可考慮主抓白背飛虱遷入代若蟲的防治以切斷毒源的進一步擴散危害。

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中圖分類號：S 432.41

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.025

收稿日期：2013-09-26

修訂日期：2014-03-01

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003031）

*通信作者E-mail：dyzhang78＠gmail.com

Sequence analysis of ORFs of segment 9 of Junan isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus

Ling Xiaoxi1， Liu Yong1，2， Zhang Songbai2， Kuang Wei2， Peng Jing2， Zhou Haoming2， Zhang Deyong1，2
（1.College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Plant Protection Institute，Changsha 410125，China）

AbstractThe full-length sequences of two ORFs of the genome segment 9（S9）of Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）isolates collected in different regions of Hunan Province was cloned and sequenced.The homology between the two ORFs of S9 in 5 isolates was higher than 99.5%.There was 3－9 mutation sites in both ORFs，but most of them were nonsense.The results of phylogenetic analysis showed that both ORFs from different variants shared high level of sequence identity and gathered in the same cluster.

Key wordsSouthern rice black-streaked dwarf virus； ORF； segment 9； sequence analysis