陳　琪，張亞瓊，葉　斌，鄭蓓佳，陶俊儒

(臺州市中心醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，浙江臺州 318000)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：200- 204

哮喘是兒童期最常見的慢性疾病之一，2005年全球哮喘防治創(chuàng)議方案將兒童哮喘作為特別難于診斷的哮喘類型之一[1]。近年來，我國兒童哮喘患病率有明顯上升趨勢，嚴重影響兒童的身心健康，也給患兒家庭和整個社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。糖皮質(zhì)激素是最有效的抗變態(tài)反應炎性藥物，而布地奈德目前唯一可以霧化吸入的糖皮質(zhì)激素。布地奈德霧化吸入后能調(diào)節(jié)細胞因子表達水平，抑制呼吸道炎性反應，明顯改善哮喘癥狀[2-3]。

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T細胞等多種炎性細胞及細胞因子參與的慢性氣道炎性反應，輔助T細胞(T helper cell，Th)1Th2平衡的破壞在哮喘的發(fā)病機制中扮演著重要的角色[4]。近期研究提示，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)也可能參與了哮喘的發(fā)?。欢鏍铑^狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(transcription factor FoxP3，F(xiàn)oxP3)在Treg細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

通過檢測受試患兒應用布地奈德后干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素- 4(interleukin- 4，IL- 4)、Treg及FoxP3的表達變化，探討布地奈德對支氣管哮喘患兒外周血IFN-γ、IL- 4及FoxP3表達的影響。

對象和方法

對象

2010年6月至2013年10月臺州市中心醫(yī)院兒科就診的支氣管哮喘患兒，診斷符合中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》(2008年修訂)標準[5]。所有患兒在入選前1個月內(nèi)未口服或靜脈應用糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑，且無免疫性疾病病史。

根據(jù)上述指南結(jié)合臨床特點將入選患兒分為輕、中、重度哮喘組。正常對照組來自臺州市中心醫(yī)院門診正常體檢兒童，無支氣管哮喘病史、家族過敏史，無近期感染性疾病史。

上述研究得到臺州市中心醫(yī)院倫理委員會批準。

觀察指標

檢測輕、中、重度哮喘組治療前后及正常對照組IFN-γ和IL- 4水平，以及表達FoxP3的CD4 Treg及亞型比例。并行哮喘控制問卷調(diào)查。

激素治療

給藥標準：輕、中度哮喘組均給予布地奈德1 mg+復方異丙托溴銨2.5 ml霧化吸入，2次d。重度哮喘組選用霧化吸入布地奈德懸液1 mg次，每6～8小時給藥1次，總療程為1～2周。

停藥標準：臨床癥狀和體征消失，恢復至急性發(fā)作前水平，或癥狀明顯減輕，發(fā)作頻率減少，程度減輕。

主要試劑及儀器

CD4-FITC、CD25-APC單克隆抗體及同型對照，以及BD FACS Calibur配套試劑均購自美國BD公司；FoxP3-PC5標記抗體購自eBioscience公司。檢測儀器為BD FACS Calibur流式細胞儀；血漿IFN-γ、IL- 4檢測采用ELISA檢測，所用試劑盒為美國BENDER公司原裝試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物公司。

標本采集

治療前血樣采取時間為患兒就診首日；治療后血樣采取時間為臨床癥狀緩解后，出院前進行抽血復查。所有對象均于清晨空腹抽取靜脈血2～4 ml，乙二胺四乙酸鉀鹽(EDTA-K2)抗凝，并及時送檢。抽取肘靜脈血5 ml靜置1 h后，3 000 rmin離心10 min 分離血漿，-80℃低溫冰箱保存。

檢測方法

Treg和FoxP3檢測：吸取100～500 μl加2～5 ml不含固定劑的紅細胞裂解液，分離有核細胞，用磷酸鹽緩沖液制成細胞濃度為1×107ml的單細胞懸液備用。多色分析法進行染色，染前按100 μl106細胞的比例加AB型血漿，4 ℃培養(yǎng)20 min，以阻斷可結(jié)晶片段(Fc)受體。分別取EDTA抗凝全血100 μl加入2個試管，各自分別加入10 μl CD4-FITCCD8-PEFoxP3-ECD，室溫下避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液1 ml，室溫避光放置15～20 min，振蕩混勻，1 500 rmin離心5 min，棄上清，用2 ml PBS洗滌1次，加入400 μl PBS重新浮懸細胞，上流式細胞儀檢測。應用BDFACSCalibur流式細胞儀配套的cellquest軟件獲取并分析10 000個細胞，同時設陰陽對照。

IFN-γ和IL- 4檢測：采用酶聯(lián)免疫分析法進行測定，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行操作，設雙孔測定，酶標儀在450 nm波長處進行測定光密度值。

統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一般情況

共納入哮喘患兒68例。其中，輕度哮喘組25例，男16例，女9例，平均年齡(6.3±4.1)歲；中度哮喘組28例，男13例，女15例，平均年齡(5.3±3.8)歲；重度哮喘組15例，男9例，女6例，平均年齡(5.8±4.5)歲。正常對照組25例，其中男12人，女13人，平均年齡(5.2±2.8)歲。4組對象性別構(gòu)成和年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

哮喘組與正常對照組比較

治療前，輕、中、重度哮喘組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表達水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨疾病加重表達下降；而IL- 4表達顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨疾病加重表達增加；IFN-γ水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。輕、中、重度哮喘組治療后上述指標與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

哮喘組治療前后比較

治療前輕、中、重度各哮喘組血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表達水平顯著低于治療后水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)；而IL- 4表達顯著高于治療后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療前，輕度哮喘組IFN-γ表達顯著低于治療后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而中、高度哮喘組與治療后相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討　　論

Treg是維持機體免疫耐受的重要調(diào)控細胞。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3位于X染色體p11.23-q13.3，含有11個編碼外顯子，2個非編碼外顯子和10個內(nèi)含子，在Treg細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。Treg是Sakaguchi等[6]在1995年發(fā)現(xiàn)的T細胞亞群，該群細胞具有免疫抑制作用，在維持機體免疫自穩(wěn)、免疫耐受和防止自身免疫性疾病的發(fā)生方面具有重要作用。

糖皮質(zhì)激素作用機制主要是抑制淋巴細胞與巨噬細胞等免疫活性細胞對多種細胞因子的合成，抑制炎性細胞趨化，提高呼吸道平滑肌β2受體反應性，減少組胺形成[7]。布地奈德為具有高效局部抗炎作用的糖皮質(zhì)激素，能增強內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和溶酶體膜的穩(wěn)定性，抑制免疫反應和降低抗體合成，從而使組胺等過敏活性介質(zhì)的釋放減少和活性降低，抑制支氣管收縮物質(zhì)的合成和釋放而減輕平滑肌的收縮反應。

本研究還應用了異丙托溴銨，該藥是一種對支氣管平滑肌有較高選擇性的強效抗膽堿藥，吸入后通過降低迷走神經(jīng)張力，使支氣管舒張、氣道分泌物減少，抑制肥大細胞釋放炎性介質(zhì)，從而獲得平喘效果[8]。

本研究顯示，布地奈德通過對哮喘患兒中FoxP3的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2免疫平衡，以達到平緩哮喘的作用。同時，各哮喘組患兒血清IL- 4水平顯著高于對照組，與疾病嚴重程度正相關(guān)，布地奈德治療后顯著回落，說明IL- 4的升高可能是哮喘發(fā)生的病理機制之一。IFN-γ能夠抑制IL- 4對B細胞的走向調(diào)節(jié)，從而制約IgE合成，起到預防和改善哮喘臨床癥狀的作用[9]。FoxP3作為Treg的特異性標記在哮喘患兒外周血中表達減少，且與疾病嚴重程度呈負相關(guān)，顯示Treg是免疫抑制細胞[10]，哮喘患兒體內(nèi)的免疫信號過表達，而通過布地奈德治療后能改善這個失衡現(xiàn)象。

表1哮喘組與正常對照組觀察指標比較

組別治療時間CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例(%)CD4+CD25+FoxP3+干擾素?γ(ng∕L)白細胞介素?4(ng∕L)輕度哮喘組(25例)治療前108±15△#47±04△#219±28△#227±27△#治療后139±2256±08265±34181±29中度哮喘組(28例)治療前114±14△#39±08△#205±34△290±56△#治療后134±1749±08235±37193±28重度哮喘組(15例)治療前99±10△#35±07△#161±32△315±33△#治療后135±2052±09199±31196±19正常對照組(25例)—137±2054±06258±34178±16

FoxP3：叉狀頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3；與對照組相比，△P<0.05；組內(nèi)治療前后比較，#P<0.05

本研究表明，布地奈德對機體免疫微環(huán)境具有優(yōu)化作用，有效糾正Th1/Th2失衡，并通過調(diào)節(jié)FoxP3的表達發(fā)揮治療作用，是其平緩哮喘的可能機制之一。

(本文圖1見封二)

[1]GINA. Global strategy for asthma management and prevention：2005 update[EBOL].(2005)[2014- 04- 07].http：www. ginasthma. comGuidelinesRes-ources. asp

[2]李明勇.布地奈德霧化吸入對哮喘兒童血漿細胞因子水平的影響及療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48：37-38.

[3]林燕梅，戴世學.布地奈德對哮喘患者痰液兩種蛋白酶及血清細胞因子的影響[J].中國實用醫(yī)藥，2008，3：26-27.

[4]趙小波.64例支氣管哮喘急性發(fā)作臨床分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9：129

[5]中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志， 2008， 46：745-753.

[6]Sakaguchi S， Sakaguchi N， Asano M， et al. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor α-chains (CD25). Breakdown of single mechanismof selftolerancecauses various autoimmune diseases[J].J Immunol， 1995， 155：1151-1164.

[7]江為民.布地奈德與特布他林治療支氣管哮喘的臨床對照研究[J].中外醫(yī)學研究，2013，11：41.

[8]杜青林.異丙托溴銨聯(lián)合舒利迭和單用舒利迭治療重度哮喘的比較[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4：114-116.

[9]Dubois A，Dcruytter N，Adams B，et al.Regulation of Th2 responses and allergic inflam mation throush bystander activation of CD8+T lymphocytes in early life[J].J Immunol，2010，185：235-239.

[10] 洪建國，董文芳，周小建.生長因子β1對兒童哮喘的作用及孟魯司特鈉對其影響[J].中華兒科雜志，2011， 49：679-684.