陳　琪，張亞瓊，葉　斌，鄭蓓佳，陶俊儒

(臺州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，浙江臺州 318000)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：200- 204

哮喘是兒童期最常見的慢性疾病之一，2005年全球哮喘防治創(chuàng)議方案將兒童哮喘作為特別難于診斷的哮喘類型之一[1]。近年來，我國兒童哮喘患病率有明顯上升趨勢，嚴(yán)重影響兒童的身心健康，也給患兒家庭和整個社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。糖皮質(zhì)激素是最有效的抗變態(tài)反應(yīng)炎性藥物，而布地奈德目前唯一可以霧化吸入的糖皮質(zhì)激素。布地奈德霧化吸入后能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平，抑制呼吸道炎性反應(yīng)，明顯改善哮喘癥狀[2-3]。

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎性反應(yīng)，輔助T細(xì)胞(T helper cell，Th)1Th2平衡的破壞在哮喘的發(fā)病機制中扮演著重要的角色[4]。近期研究提示，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)也可能參與了哮喘的發(fā)病；而叉狀頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(transcription factor FoxP3，F(xiàn)oxP3)在Treg細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

通過檢測受試患兒應(yīng)用布地奈德后干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素- 4(interleukin- 4，IL- 4)、Treg及FoxP3的表達(dá)變化，探討布地奈德對支氣管哮喘患兒外周血IFN-γ、IL- 4及FoxP3表達(dá)的影響。

對象和方法

對象

2010年6月至2013年10月臺州市中心醫(yī)院兒科就診的支氣管哮喘患兒，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》(2008年修訂)標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有患兒在入選前1個月內(nèi)未口服或靜脈應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑，且無免疫性疾病病史。

根據(jù)上述指南結(jié)合臨床特點將入選患兒分為輕、中、重度哮喘組。正常對照組來自臺州市中心醫(yī)院門診正常體檢兒童，無支氣管哮喘病史、家族過敏史，無近期感染性疾病史。

上述研究得到臺州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

觀察指標(biāo)

檢測輕、中、重度哮喘組治療前后及正常對照組IFN-γ和IL- 4水平，以及表達(dá)FoxP3的CD4 Treg及亞型比例。并行哮喘控制問卷調(diào)查。

激素治療

給藥標(biāo)準(zhǔn)：輕、中度哮喘組均給予布地奈德1 mg+復(fù)方異丙托溴銨2.5 ml霧化吸入，2次d。重度哮喘組選用霧化吸入布地奈德懸液1 mg次，每6～8小時給藥1次，總療程為1～2周。

停藥標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀和體征消失，恢復(fù)至急性發(fā)作前水平，或癥狀明顯減輕，發(fā)作頻率減少，程度減輕。

主要試劑及儀器

CD4-FITC、CD25-APC單克隆抗體及同型對照，以及BD FACS Calibur配套試劑均購自美國BD公司；FoxP3-PC5標(biāo)記抗體購自eBioscience公司。檢測儀器為BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀；血漿IFN-γ、IL- 4檢測采用ELISA檢測，所用試劑盒為美國BENDER公司原裝試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物公司。

標(biāo)本采集

治療前血樣采取時間為患兒就診首日；治療后血樣采取時間為臨床癥狀緩解后，出院前進(jìn)行抽血復(fù)查。所有對象均于清晨空腹抽取靜脈血2～4 ml，乙二胺四乙酸鉀鹽(EDTA-K2)抗凝，并及時送檢。抽取肘靜脈血5 ml靜置1 h后，3 000 rmin離心10 min 分離血漿，-80℃低溫冰箱保存。

檢測方法

Treg和FoxP3檢測：吸取100～500 μl加2～5 ml不含固定劑的紅細(xì)胞裂解液，分離有核細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液制成細(xì)胞濃度為1×107ml的單細(xì)胞懸液備用。多色分析法進(jìn)行染色，染前按100 μl106細(xì)胞的比例加AB型血漿，4 ℃培養(yǎng)20 min，以阻斷可結(jié)晶片段(Fc)受體。分別取EDTA抗凝全血100 μl加入2個試管，各自分別加入10 μl CD4-FITCCD8-PEFoxP3-ECD，室溫下避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，室溫避光放置15～20 min，振蕩混勻，1 500 rmin離心5 min，棄上清，用2 ml PBS洗滌1次，加入400 μl PBS重新浮懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀配套的cellquest軟件獲取并分析10 000個細(xì)胞，同時設(shè)陰陽對照。

IFN-γ和IL- 4檢測：采用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行測定，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)雙孔測定，酶標(biāo)儀在450 nm波長處進(jìn)行測定光密度值。

統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

一般情況

共納入哮喘患兒68例。其中，輕度哮喘組25例，男16例，女9例，平均年齡(6.3±4.1)歲；中度哮喘組28例，男13例，女15例，平均年齡(5.3±3.8)歲；重度哮喘組15例，男9例，女6例，平均年齡(5.8±4.5)歲。正常對照組25例，其中男12人，女13人，平均年齡(5.2±2.8)歲。4組對象性別構(gòu)成和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

哮喘組與正常對照組比較

治療前，輕、中、重度哮喘組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表達(dá)水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨疾病加重表達(dá)下降；而IL- 4表達(dá)顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨疾病加重表達(dá)增加；IFN-γ水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。輕、中、重度哮喘組治療后上述指標(biāo)與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

哮喘組治療前后比較

治療前輕、中、重度各哮喘組血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表達(dá)水平顯著低于治療后水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)；而IL- 4表達(dá)顯著高于治療后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療前，輕度哮喘組IFN-γ表達(dá)顯著低于治療后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而中、高度哮喘組與治療后相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

討　　論

Treg是維持機體免疫耐受的重要調(diào)控細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3位于X染色體p11.23-q13.3，含有11個編碼外顯子，2個非編碼外顯子和10個內(nèi)含子，在Treg細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。Treg是Sakaguchi等[6]在1995年發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，該群細(xì)胞具有免疫抑制作用，在維持機體免疫自穩(wěn)、免疫耐受和防止自身免疫性疾病的發(fā)生方面具有重要作用。

糖皮質(zhì)激素作用機制主要是抑制淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞對多種細(xì)胞因子的合成，抑制炎性細(xì)胞趨化，提高呼吸道平滑肌β2受體反應(yīng)性，減少組胺形成[7]。布地奈德為具有高效局部抗炎作用的糖皮質(zhì)激素，能增強內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和溶酶體膜的穩(wěn)定性，抑制免疫反應(yīng)和降低抗體合成，從而使組胺等過敏活性介質(zhì)的釋放減少和活性降低，抑制支氣管收縮物質(zhì)的合成和釋放而減輕平滑肌的收縮反應(yīng)。

本研究還應(yīng)用了異丙托溴銨，該藥是一種對支氣管平滑肌有較高選擇性的強效抗膽堿藥，吸入后通過降低迷走神經(jīng)張力，使支氣管舒張、氣道分泌物減少，抑制肥大細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，從而獲得平喘效果[8]。

本研究顯示，布地奈德通過對哮喘患兒中FoxP3的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2免疫平衡，以達(dá)到平緩哮喘的作用。同時，各哮喘組患兒血清IL- 4水平顯著高于對照組，與疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)，布地奈德治療后顯著回落，說明IL- 4的升高可能是哮喘發(fā)生的病理機制之一。IFN-γ能夠抑制IL- 4對B細(xì)胞的走向調(diào)節(jié)，從而制約IgE合成，起到預(yù)防和改善哮喘臨床癥狀的作用[9]。FoxP3作為Treg的特異性標(biāo)記在哮喘患兒外周血中表達(dá)減少，且與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，顯示Treg是免疫抑制細(xì)胞[10]，哮喘患兒體內(nèi)的免疫信號過表達(dá)，而通過布地奈德治療后能改善這個失衡現(xiàn)象。

表1哮喘組與正常對照組觀察指標(biāo)比較

組別治療時間CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例(%)CD4+CD25+FoxP3+干擾素?γ(ng∕L)白細(xì)胞介素?4(ng∕L)輕度哮喘組(25例)治療前108±15△#47±04△#219±28△#227±27△#治療后139±2256±08265±34181±29中度哮喘組(28例)治療前114±14△#39±08△#205±34△290±56△#治療后134±1749±08235±37193±28重度哮喘組(15例)治療前99±10△#35±07△#161±32△315±33△#治療后135±2052±09199±31196±19正常對照組(25例)—137±2054±06258±34178±16

FoxP3：叉狀頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3；與對照組相比，△P<0.05；組內(nèi)治療前后比較，#P<0.05

本研究表明，布地奈德對機體免疫微環(huán)境具有優(yōu)化作用，有效糾正Th1/Th2失衡，并通過調(diào)節(jié)FoxP3的表達(dá)發(fā)揮治療作用，是其平緩哮喘的可能機制之一。

(本文圖1見封二)

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